Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

الكتاب أريد أن أشكر أعضاء سابقون وحاليون في أدولفو غارسيا ساستري وبيتر باليس مختبرات لتطوير تقنيات الوراثة عكس الإنفلونزا والبلازميدات. وتمول جزئيا البحوث في مختبرات AG - S و التراث ، وهو مركز NIAID الممولة من التميز لأبحاث الأنفلونزا ومراقبة (HHSN266200700010C) ، ومنح NIAD R01AI046954 ، وU01AI070469 P01AI058113. ويمول جزئيا البحث في LM - S المختبر منح NIAID RO1AI077719.

1. فيروس الانفلونزا ترنسفكأيشن الانقاذ فيروس انفلونزا تنتمي إلى أسرة Orthomyxoviridae فيروسات الحمض النووي الريبي يلفها السلبية الذين تقطعت بهم السبل. الأنفلونزا فيروس A الجينوم يتكون من ثمانية جينات مختلفة من الحمض النووي الريبي ا?...

<ol>
	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

الانقاذ من فيروسات الانفلونزا المؤتلف من الحمض النووي البلازميد هو عملية بسيطة ومباشرة مرة واحدة يتم تنفيذ البروتوكول بشكل روتيني في المختبر ، ولكن في البداية ، يمكن للعديد من الأمور على غير ما يرام. لا بد أن يكون إعداد البلازميد جيدة لتوليد الفيروس. الصيانة السليمة...

خطوط خلية 293T (رقم الكتالوج CRL - 11268) وMDCK (رقم الكتالوج CCL - 34) تمسك خطوط الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 في FBS 10 ٪ DMEM ، PS 1 ٪. الخلايا هي شكل متاح للثقافة الأمريكية نوع مجموعة (آي تي ​​سي سي ، 10801 جامعة بوليفارد ، ماناساس بولاية فرجينيا. 20110-2209 الولايات المتحدة). بيض الدجاج المحتوي ويمكن الحصول على المحتوي بيض الدجاج 10 يوما من عمره من مختبرات نهر تشارلز ، رسوم محددة الطيور المرضي التموين (SPAFAS) منتجات الطيور والخدمات. فرانكلين العموم ، 106 شارع 32 ، شمال فرانكلين ، CT 06254 الولايات المتحدة الأمريكية. يتم تحضين البيض عند 37 درجة مئوية السابقة وبعد العدوى الفيروسية. قبل وبعد العدوى الفيروسية ، وcandled البيض لتحديد الجدوى من الأجنة. من المهم جدا أن نبحث عن البيض الموتى قبل وبعد العدوى الفيروسية. يمكن أن تكون العدوى قبل بيضة بالرصاص رصدت بسهولة بسبب عدم وجود الأوعية الدموية ، فضلا عن غياب الحراك الجنين. عندما candled والأجنة الحية التحرك. وبعد عدوى فيروسية تكون البويضة ميتة (ربما تتعلق عدوى فيروس الأنفلونزا) رصدت بسهولة عن طريق مظهر سيئ للبويضة من وجهة نظر حجم أصغر ودموية من السوائل السقاء. يتم التخلص من المصابين ، في أكياس البيض autoclavable المزدوجة وتعقيمها وفقا للإجراءات القياسية. الدجاج خلايا الدم الحمراء (RBC) يمكن شراؤها من مزارع الدجاج RBC Truslow ، 201 شارع وادي ، Chestertown ، MD 21620. المحل في 4 درجات مئوية. لفحوصات HA ، وغسل 5 مل من RBC الدجاج مع 45 مل من 1X PBS الطرد المركزي في أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 RPMS ، RT. تجاهل طاف بعناية واستخدام التخفيف 1:1000 من مكعبات في RBC 1X PBS (تركيز النهائي من RBC 0،5-1،0 ٪). supernatants زراعة الأنسجة وسوائل السقائي ويمكن تخزين كل من زراعة الأنسجة ، والسوائل supernatants السقائي في 4 درجات مئوية لفترة قصيرة من الزمن. بعد التأكد من فيروس الانقاذ ، يتم تخزين الفيروسات من supernatants الخلية أو السوائل في السقاء -80 درجة مئوية. البلازميدات وتعد جميع البلازميدات باستخدام طقم توصيات ماكسي البلازميد المصنعة التالية. جميع البلازميدات هي قسامة بتركيزات من 1 ميكروغرام / مل في DDH 2 O وتخزينها على -20 درجة مئوية. للتخزين على المدى القصير ، يمكن أن يكون الحفاظ على البلازميد في 4 درجات مئوية. يتم تحديد تركيز الحمض النووي البلازميد تنقيته بواسطة القياس الطيفي عند 260 نانومتر ، والتي تقدر نسبة النقاء باستخدام نانومتر 260:280. وتعتبر نسب الاستعدادات مع 1،8-2،0 نانومتر 260:280 المخصصة لأغراض الإنقاذ الفيروس. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي التركيز أكد البلازميد والنقاء مع agarose هلام اللوني. موضحة Ambisense pDZ البلازميدات (6) تحتوي على ثمانية جينات الأنفلونزا A/PR/8/34 الفيروسي (7) في الشكل 2. الفيروسات لا يمكن أن يؤديها في وصفها لانقاذ بروتوكول الأنفلونزا A/PR/8/34 تحت مستوى السلامة الأحيائية (BSL) 2 شروطه. ويجب تعقيم المواد الملوثة ، بما في ذلك supernatants زراعة الأنسجة والبيض المحتوي ، قبل التخلص منها. قد الانقاذ من فيروس الانفلونزا ظروف أخرى تتطلب أعلى BSL ، وبالتالي ، الشروط الخاصة / مقاييس الأمن وسوف يتعين اتباعها. زراعة الأنسجة وسائل الاعلام والحلول DMEM 10 ٪ FBS PS 1 ٪ : 445 مل Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) ، و 50 مل من مصل بقري جنيني (FBS) ، و 5 مل من البنسلين 100X / الستبرتوميسين (PS). المحل في 4 درجات مئوية. وسيتم استخدام هذه الوسائط للحفاظ على خلايا 293T MDCK وكذلك لtransfections. DMEM BA 0.3 ٪ 1 ٪ PS : 495.7 مل من DMEM ، 4.3 مل من 35 ٪ من الأبقار الزلال (BA). المحل في 4 درجات مئوية. قبل الاستخدام ، إضافة إلى تعامل TPCK التربسين تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / لتر. المعدية وسائل الإعلام. 10X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) : 80 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 2 غرام من بوكل ، 11.5 غراما من نا 2 4 هبو 0.7 H 2 O ، 2 غرام من KH 2 PO 4. إضافة DDH 2 O يصل إلى 1 لتر. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.3. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف. تخزين في درجة حرارة الغرفة. 1X PBS : خفف 10X مع PBS 01:10 DDH 2 O. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

وقد بذلت جهود من قبل عدد من المجموعات البحثية الأنفلونزا محوريا في تطوير وتحسين الأنفلونزا من الوراثة عكس الفيروس. أنشئت أصلا في عام 1999<sup&gt; 1،2</sup&gt; البلازميد المستندة إلى التقنيات الجينية العكسية لتوليد المؤتلف فيروسات أحدثت ثورة في مجال البحوث الأنفلونزا لأنه تم الرد على أسئلة محددة من قبل والمعدية وراثيا ، المؤتلف فيروسات الانفلونزا. مثل هذه الدراسات تشمل تكاثر الفيروس ، وظيفة من البروتينات الفيروسية ، ومساهمة من طفرات معينة في البروتينات الفيروسية في تكاثر الفيروس و / أو المرضية ، وأيضا ، وناقلات الفيروسية باستخدام فيروسات الأنفلونزا المؤتلف معربا عن البروتينات الخارجية<sup&gt; 3</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

الانقاذ من فيروسات الانفلونزا من الحمض النووي البلازميد هو تقنية أساسية وضرورية التجريبية التي تسمح للباحثين لتوليد فيروسات الانفلونزا المؤتلف لدراسة جوانب متعددة في البيولوجيا من فيروس الانفلونزا ، وإلى أن تستخدم ناقلات المحتملة أو اللقاحات.

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

التعبير عن المؤتلف وظيفية راصة دموية والبروتينات النورامينيداز من الفيروسات الأنفلونزا H7N9 رواية باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

إدارة الأنف المؤتلف لقاحات الأنفلونزا في همي ماوس نماذج لدراسة الأغشية المخاطية الحصانة

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

الجيل المؤتلف الإنسان مفتش حيدة النسيلة من مخلد خلايا التصنيف B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

الأنف المسحات لمكافحة الأنفلونزا A الكشف عن الفيروسات وعزل من الخنازير

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...