Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
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作者想感谢的阿道夫加西亚 - 萨斯特雷和Peter Palese实验室为流感反向遗传学技术和质粒发展的过去和现在的成员。在AG - S的实验室研究的部分资金由CRIP，卓越NIAID资助流感研究和监测中心（HHSN266200700010C）NIAD补助R01AI046954，U01AI070469和P01AI058113。 LM - S的实验室的研究经费部分由NIAID的赠款RO1AI077719。

1。流感病毒救援转 A型流感病毒属于负链RNA包膜病毒的 Orthomyxoviridae家庭。 A型流感病毒的基因组由8个不同的RNA负极的基因编码，至少11病毒蛋白（图1） 4。在这份报告中，我们将重点抢救其中一个最常见的实验室菌株，使用含8流感病毒A/PR/8/34段ambisense质粒（PDZ）流感A/PR/8/34，5 （图2）。 对于抢救质粒DNA的重组流感病毒，我们建议3?...

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

质粒DNA的重组流感病毒的救援是一个简单明了的过程，一旦该协议是经常在实验室中进行，但在开始的时候，多个事情都可能出错。生成的病毒，它必须有良好的质粒准备。正确保养的细胞株（293T和MDCK）是一个成功的病毒救援的关键。传统上，一个遗传标记是插入基因编码质粒流感，沉默突变。这种沉默突变（S）的简介和创作，例如，一个新的限制性内切酶站点是用来区分野生型和经酶切重组?...

细胞系 293T（目录号CRL - 11268）和MDCK（目录号CCL - 34）细胞株维持在37℃孵化器与5％CO2的DMEM 10％FBS，1％的PS 2。细胞是形成美国典型培养物保藏（ATCC 10801大学大道，马纳萨斯，弗吉尼亚州20110-2209美国）。 鸡胚查尔斯河实验室，特定病原体费禽流供应（SPAFAS）禽流感的产品和服务，可从10日龄的鸡胚的鸡蛋。富兰克林风景，106路线32，北富兰克林，CT 06254 USA。在37 ° C前和病毒感染后的鸡蛋孵育。在病毒感染后，鸡蛋candled，以确定胚胎的可行性。死蛋前后病毒感染，这是非常重要。感染前一个死蛋，可以很容易地发现通过血管的情况下，以及胚胎的流动性的情况下。当candled，活胚胎移动。死蛋（可能与流感病毒感染）病毒感染后会由尿囊液的体积较小和血腥的蛋坏的外观很容易被发现。受感染的鸡蛋被丢弃在双高压灭菌袋和蒸压以下的标准程序。 鸡红血细胞（红细胞） 鸡红细胞可以购买从Truslow农场，谷道，201 Chestertown，MD 21620。保存在4 ° C。对于HA测定，用45毫升的PBS 1X在50 mL离心管5毫升的鸡红细胞。 1000 RPM的，RT离心5分钟。小心倒掉上清，用1:1000稀释的1X PBS中沉淀的红细胞（终浓度为0.5-1.0％红细胞）。 组织培养上清和尿囊液可以储存在4 ° C，很短的时间内，组织培养上清和尿囊液。在确认病毒救援后，病毒从细胞培养上清或尿囊液储存在-80 ° C 质粒所有质粒准备用一个质粒马克西Kit中的下列制造商的建议。质粒浓度为1微克/毫升分装在DDH 2，储存在-20 ° C短期储存，质粒可以保持在4 ° C。纯化DNA质粒的浓度是由分光光度法在260 nm，纯度估计使用260:280 nm的比例。 1.8-2.0 260:280纳米比率的准备工作被认为是病毒救援目的的拨款。此外，质粒的浓度和纯度应确认与琼脂糖凝胶色谱。 Ambisense PDZ质粒（6），其中包含8个流感A/PR/8/34病毒基因（7）如图2所示。 病毒生物安全水平（BSL）2条件下可以进行挽救流感A/PR/8/34协议。污染物质，包括组织培养上清和鸡胚，处置前应消毒。救援其他流感病毒可能需要更高的BSL条件，因此，特殊条件/安全的测量，将需要遵循。 组织文化，媒体和解决方案 DMEM培养液10％胎牛血清的1％PS：445毫升贝科改良Eagle培养基（DMEM），胎牛血清（FBS），50毫升，100X青霉素/链霉素（PS）和5毫升。保存在4 ° C。此媒体将被用来保持293T和MDCK细胞的转染以及。的DMEM 0.3％BA 1％PS：495.7毫升的DMEM，35％的牛白蛋白（BA）的4.3毫升。保存在4 ° C。使用前，TPCK处理的胰蛋白酶添加到终浓度为1微克/毫升。传染病媒体。 10X磷酸盐缓冲液（PBS）：80克氯化钠，氯化钾2克，11.5克的Na 2 HPO 4 0.7 H 2 O 2克的KH 2 PO 4。添加DDH 2到1升。调节pH值至7.3。消毒高压灭菌。在室温下储存。 1X PBS稀释10X PBS 1:10 DDH 2 O。消毒的高压灭菌器和在室温下储存。

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

多项流感研究小组的努力已在A型流感病毒反向遗传学的发展和改善的关键。成立于1999年<sup&gt; 1,2</sup&gt;质粒为基础的反向遗传技术，以产生重组病毒已经彻底改变了流感研究领域，因为具体问题，通过基因工程，传染病，重组流感病毒已回答。这些研究包括病毒的复制，病毒蛋白的功能，特定的突变病毒蛋白在病毒复制和/或发病机制中的贡献，此外，使用病毒载体表达外源蛋白的重组流感病毒<sup&gt; 3</sup&gt;。

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

质粒DNA的A型流感病毒的救援是一个基本的和必要的实验技术，使流感的研究人员，以产生重组病毒在流感病毒的生物学特性研究的多个方面，被视为潜在的载体或疫苗使用。

质粒DNA重组流感病毒的一代

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

流感病毒的高通量检测方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

科研

免疫与感染

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

流感病毒从感染细胞的染色质的核糖核蛋白复合物的亲和纯化

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

从救援的cDNA重组新城疫病毒

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

从新型H7N9流感病毒利用杆状病毒表达系统的功能重组血凝素和神经氨酸酶蛋白的表达

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

在鸡胚的流感病毒传播

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

重组流感疫苗的嵌合体小鼠模型鼻腔给药研究黏膜免疫

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

从排序的永生B细胞产生的重组人IgG单克隆抗体

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

鼻湿巾从猪流感病毒检测和​​隔离

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

在甲型流感病毒的衣壳的体外拆卸梯度离心

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

来自新世界Zika病毒感染性克隆的重组病毒的救援和表征

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...