Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

De auteurs willen heden en verleden leden bedanken de Adolfo García-Sastre en Peter Palese laboratoria voor de ontwikkeling van influenza reverse genetics technieken en plasmiden. Onderzoek in AG-S laboratoria wordt gedeeltelijk gefinancierd door CRIP, een NIAID gefinancierde Center of Excellence voor de Influenza Onderzoek en Surveillance (HHSN266200700010C) en door NIAD beurzen R01AI046954, U01AI070469 en P01AI058113. Onderzoek in LM-S laboratorium wordt gedeeltelijk gefinancierd door NIAID verlenen RO1AI077719.

1. Influenza virus te redden transfectie Influenza A-virus behoort tot de familie van negatieve Orthomyxoviridae-stranded RNA-virussen met een envelop. De influenza A-virus genoom bestaat uit acht verschillende RNA-genen van negatieve polariteit die coderen, op zijn minst, 11 virale eiwitten (figuur 1) 4. We zullen, focus in dit rapport, over de redding van een van de meest voorkomende laboratorium stam, influenza A/PR/8/34, 5 met behulp van ambisense plasmiden (...

<ol>
	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Redding van recombinant influenza virussen uit het plasmide DNA is een eenvoudig en duidelijk proces zodra het protocol routinematig wordt uitgevoerd in het laboratorium, maar in het begin, meerdere dingen mis kan gaan. Het is noodzakelijk om een ​​goede voorbereiding plasmide hebben om het virus te genereren. Goed onderhoud van de cellijnen (293T en MDCK) is cruciaal voor een succesvolle viral te redden. Traditioneel wordt een genetische tag ingevoegd in een influenza gen-codering plasmide, door stille mutagenese. ...

Cellijnen 293T (catalogusnummer CRL-11268) en MDCK (catalogusnummer CCL-34) cellijnen worden onderhouden in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Cellen zijn beschikbare vorm van de American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110 tot 2209 USA). Bevruchte kippeneieren Bevruchte 10-dagen oude kippen eieren kan worden verkregen van Charles River Laboratories, Specifiek Pathogeen Aviaire Fee Supply (SPAFAS) Aviaire Producten en Diensten. Franklin Commons, 106 Route 32, Noord-Franklin, CT 06254 USA. Eieren worden uitgebroed op 37 ° C voorafgaand aan en na de virale infectie. Voor en na virale infectie, zijn eieren schouwing van de levensvatbaarheid van de embryo&#39;s te bepalen. Het is zeer belangrijk om voor de dode eieren er voor en na de virale infectie. Vóór infectie een dode ei kan gemakkelijk worden gezien door de afwezigheid van bloedvaten, alsmede de afwezigheid van embryo mobiliteit. Bij schouwing, levende embryo&#39;s te verplaatsen. Na het virale infectie een dode ei (waarschijnlijk gerelateerd aan influenza virus infectie), zal gemakkelijk worden gespot door de slechte uitstraling van het ei zoals gezien door de kleinere en bloedige volume van allantoïsvocht. Geïnfecteerde-eieren worden weggegooid in dubbele autoclaveerbare zakken en geautoclaveerd volgens standaard procedures. Kip rode bloedcellen (RBC) Kip RBC kan worden gekocht van Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Bewaren bij 4 ° C. Voor HA testen, was 5 ml van de kip RBC met 45 ml PBS 1X in een centrifugebuis van 50 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000 rpm&#39;s, RT. Gooi voorzichtig het supernatant en gebruik een verdunning van 1:1000 van het ingehulde RBC in PBS 1X (uiteindelijke concentratie van 0,5-1,0% RBC). Tissue kweeksupernatanten en allantoïsvocht Beide, weefsel kweeksupernatanten en allantoïsvocht kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor een korte periode van tijd. Na het bevestigen virus te redden, zijn virussen uit celsupernatanten of allantoïsvocht opgeslagen bij -80 ° C. Plasmids Alle plasmiden worden bereid met een plasmide maxi kit volgende aanbevelingen van de fabrikant. Alle plasmiden zijn fractie bij concentraties van 1 ug / ml in DDH 2 O en opgeslagen bij -20 ° C. Voor korte-termijn opslag, kan het plasmide te houden bij 4 ° C. De concentratie van de gezuiverde DNA-plasmide wordt bepaald spectrofotometrisch bij 260 nm, met een zuiverheid wordt geschat met behulp van de 260:280 nm ratio. Preparaten met 1,8-2,0 260:280 nm ratio&#39;s worden beschouwd als bestemmen voor virus te redden doeleinden. Bovendien moeten plasmide concentratie en zuiverheid worden bevestigd met agarose gel chromatografie. Ambisense PDZ plasmiden (6) met daarin de acht influenza A/PR/8/34 virale genen (7) zijn aangegeven in figuur 2. Virussen De beschreven protocol voor het redden van influenza A/PR/8/34 kan worden uitgevoerd onder bioveiligheidsniveau (BSL) twee voorwaarden. Verontreinigd materiaal, waaronder tissue kweeksupernatanten en bevruchte eieren, moeten worden gesteriliseerd weg te doen. Redding van andere influenza virus kan een hogere BSL omstandigheden en dus bijzondere voorwaarden / security metingen moeten worden gevolgd. Weefselkweek media en oplossingen DMEM 10% FBS 1% PS: 445 ml Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM), 50 ml foetaal runderserum (FBS), en 5 ml van de 100X penicilline / streptomycine (PS). Bewaren bij 4 ° C. Deze media worden gebruikt om de 293T en MDCK cellen alsmede voor de transfecties te behouden. DMEM 0,3% BA 1% PS: 495,7 ml DMEM, 4,3 ml van 35% runderalbumine (BA). Bewaren bij 4 ° C. Net voor gebruiken, voegt TPCK behandeld trypsine tot een uiteindelijke concentratie van 1 ug / ml. Besmettelijke media. 10X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS): 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na 2 HPO 4 0.7 H 2 O, 2 g KH 2 PO 4. Voeg DDH 2 O tot 1 liter. Pas de pH op 7,3. Steriliseren in autoclaaf. Bewaren bij kamertemperatuur. 1X PBS: Verdun 10X PBS 1:10 met DDH 2 O. Steriliseren in autoclaaf en bewaar bij kamertemperatuur.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Inspanningen van een aantal influenza onderzoeksgroepen zijn de spil in de ontwikkeling en verbetering van het influenza A virus reverse genetics. Oorspronkelijk opgericht in 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; Plasmide-gebaseerde omgekeerde genetische technieken om recombinante virussen te genereren hebben een revolutie in de influenza gebied van onderzoek, omdat specifieke vragen zijn beantwoord door genetisch gemanipuleerde, besmettelijke, recombinant influenza virussen. Dergelijke studies omvatten virus replicatie, de functie van de virale eiwitten, de bijdrage van specifieke mutaties in virale eiwitten in de virale replicatie en / of de pathogenese en, ook, virale vectoren met behulp van recombinante influenza virussen uiten van vreemde eiwitten<sup&gt; 3</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Redding van influenza A-virussen uit het plasmide DNA is een fundamentele en essentiële experimentele techniek die het mogelijk maakt influenza onderzoekers recombinante virussen te genereren om meerdere aspecten in de biologie van influenza virus te bestuderen en om te worden gebruikt als potentiële vectoren of vaccins.

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Expressie van Functionele Recombinant Hemagglutinine en neuraminidase Eiwitten uit de roman H7N9 Influenza Virus Met de baculovirusexpressiesysteem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasale Doekjes voor het influenza A-virus detectie en isolatie van Varkens

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Redding en karakterisering van het recombinante virus van een nieuwe infectieuze kloon van de Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...