Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
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Les auteurs tiennent à remercier les membres passés et présents dans la Adolfo García-Sastre et Peter Palese laboratoires pour le développement des techniques de génétique inverse de la grippe et les plasmides. La recherche dans les laboratoires de AG-S est partiellement financé par CRIP, un centre financé par le NIAID d&#39;excellence pour la recherche sur l&#39;influenza et de surveillance (HHSN266200700010C) et par des subventions NIAD R01AI046954, U01AI070469 et P01AI058113. La recherche en LM-S laboratoire est partiellement financé par le NIAID octroi RO1AI077719.

1. Transfection grippe du virus de secours Virus Influenza A appartient à la famille des Orthomyxoviridae des virus à ARN négatif brin enveloppé. La grippe A génome du virus est constitué de huit gènes de l&#39;ARN de polarité négative différents qui codent au moins 11 protéines virales (figure 1) 4. Nous allons nous concentrer, dans ce rapport, sur le sauvetage de l&#39;un de la souche de laboratoire la plus courante, la grippe A/PR/8/34, 5 l&#39;aide...

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Sauvetage des virus grippaux recombinants de l&#39;ADN plasmidique est un processus simple et direct une fois le protocole est systématiquement réalisée dans le laboratoire, mais au début, de multiples choses peuvent aller mal. Il est impératif d&#39;avoir une bonne préparation de plasmide pour générer le virus. Un bon entretien des lignées cellulaires (293T et MDCK) est crucial pour un sauvetage réussi virale. Traditionnellement, un marqueur génétique est inséré dans une gène de la grippe plasmide codant...

Les lignées cellulaires 293T (numéro de catalogue CRL-11268) et MDCK (numéro de catalogue CCA-34) des lignées de cellules sont maintenues dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 dans du DMEM 10% FBS, 1% de PS. Les cellules sont disponibles sous forme de l&#39;American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, en Virginie. 20110-2209 USA). Œufs de poule embryonnés Oeufs embryonnés de poulet de 10 jours anciens peuvent être obtenus auprès de Charles River Laboratories, spécifiques d&#39;alimentation pathogènes aviaire Fee (SPAFAS) Produits et Services aviaire. Communes Franklin, 106 Route 32, au nord de Franklin, CT 06254 USA. Les œufs sont incubés à 37 ° C avant et après l&#39;infection virale. Avant et après l&#39;infection virale, les œufs sont mirés pour déterminer la viabilité des embryons. Il est très important de chercher des oeufs morts, avant et après l&#39;infection virale. Avant l&#39;infection d&#39;un œuf mort peut être facilement repéré par l&#39;absence de vaisseaux sanguins ainsi que l&#39;absence de mobilité embryon. Lorsque mirés, embryons vivants se déplacer. Après l&#39;infection virale d&#39;un oeuf mort (probablement liée à l&#39;infection du virus de la grippe) seront facilement repérés par le mauvais aspect de l&#39;œuf comme on le voit par le volume plus petit et sanglante du liquide allantoïdien. Infected-œufs sont jetés dans un double sac autoclavable et autoclavés suivant les procédures standard. Cellules de sang de poulet rouges (RBC) Poulet RBC peuvent être achetés auprès de fermes Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, MD 21620. Conserver à 4 ° C. Pour les dosages HA, laver 5 ml de la RBC de poulet avec 45 ml de PBS 1X dans un tube à centrifuger de 50 ml. Centrifuger pendant 5 minutes à 1000 RPM, RT. Jeter soigneusement le surnageant et d&#39;utiliser une dilution de 1:1000 de l&#39;granulés en PBS 1X RBC (concentration finale de 0,5-1,0% RBC). Surnageants de culture de tissus et liquides allantoïdiens Les deux, les surnageants de culture de tissus et les liquides allantoïdien peut être conservé à 4 ° C pendant une courte période de temps. Après avoir confirmé le sauvetage du virus, les virus à partir de surnageants de cellules ou de fluide allantoïdien sont stockés à -80 ° C. Les plasmides Tous les plasmides sont préparés en utilisant les recommandations d&#39;un fabricant maxi kit plasmidique suivant. Tous les plasmides sont aliquot à des concentrations de 1 ug / ml dans le trou DDH 2 O et stocké à -20 ° C. Pour stockage à court terme, le plasmide peut être garder à 4 ° C. La concentration de l&#39;ADN plasmidique purifié est déterminée par spectrophotométrie à 260 nm, avec une pureté d&#39;être estimée en utilisant le ratio 260:280 nm. Préparations à 1,8 à 2,0 nm 260:280 ratios sont considérés comme affectés à des fins de sauvetage virus. De plus, la concentration et la pureté plasmidique doit être confirmé par chromatographie sur gel d&#39;agarose. Ambisens PDZ plasmides (6) contenant les huit gènes viraux de la grippe A/PR/8/34 (7) sont illustrés dans la Figure 2. Virus Le protocole décrit pour le sauvetage de la grippe A/PR/8/34 peut être effectuée sous du niveau de biosécurité (BSL) 2 conditions. Le matériel contaminé, y compris les surnageants de culture des tissus et des œufs embryonnés, doivent être stérilisés avant leur élimination. Sauvetage des virus de la grippe d&#39;autres peuvent exiger des conditions BSL supérieur et, par conséquent, des conditions particulières / mesures de sécurité devront être respectées. Milieux de culture tissulaire et des solutions DMEM 10% FBS 1% PS: 445 ml de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS), et 5 ml de 100X pénicilline / streptomycine (PS). Conserver à 4 ° C. Ce support sera utilisé pour maintenir les cellules 293T et MDCK ainsi que pour les transfections. BA DMEM 0,3% à 1% PS: 495,7 ml de DMEM, 4,3 ml de 35% d&#39;albumine bovine (BA). Conserver à 4 ° C. Juste avant utilisation, ajouter la trypsine TPCK traitée à une concentration finale de 1 ug / ml. Les médias infectieuses. Phosphate 10X saline tamponnée (PBS): 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g de KH 2 PO 4. Ajouter ddH 2 O jusqu&#39;à 1 litre. Ajuster le pH à 7,3. Stériliser par autoclave. Stocker à température ambiante. PBS 1X: Diluer PBS 10X 1:10 avec ddH 2 O. Stériliser par autoclave et stocker à température ambiante.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Les efforts déployés par un certain nombre de groupes de recherche sur la grippe ont été crucial dans le développement et l&#39;amélioration de la grippe A génétique inverse du virus. Initialement créé en 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; À base de plasmide techniques de génétique inverse pour générer des virus recombinants ont révolutionné le domaine de recherche sur la grippe à cause des questions spécifiques ont été répondues par génie génétique, infectieuse, virus grippaux recombinants. De telles études incluent la réplication du virus, la fonction des protéines virales, la contribution des mutations spécifiques dans les protéines virales dans la réplication virale et / ou la pathogénie et, aussi, en utilisant des vecteurs viraux virus grippaux recombinants exprimant des protéines étrangères<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Sauvetage des virus grippaux A partir de l&#39;ADN plasmidique est une technique de base et essentiels expérimentale qui permet aux chercheurs de la grippe pour générer des virus recombinants pour étudier les multiples aspects de la biologie du virus de la grippe, et pour être utilisés comme vecteurs potentiels ou de vaccins.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Recherche

Immunologie et infection

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d&#39;ADNc

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

L&#39;expression de l&#39;hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l&#39;aide du système d&#39;expression baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Administration intranasale de vaccins contre la grippe recombinant chimérique dans les modèles de souris pour étudier l&#39;immunité muqueuse

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Lingettes nasal pour la grippe détection d&#39;un virus et l&#39;isolement des porcs

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d&#39;un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...