Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
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Die Autoren wollen in Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder in den Adolfo García-Sastre und Peter Palese Labors danken für die Entwicklung der Influenza reversen Genetik Techniken und Plasmide. Research in AG-S Labors wird teilweise durch CRIP, ein NIAID finanzierten Center of Excellence für Forschung und Influenza Surveillance (HHSN266200700010C) und durch NIAD gewährt R01AI046954, U01AI070469 und P01AI058113 finanziert. Research in LM-S Labor wird teilweise durch NIAID gewähren RO1AI077719 finanziert.

1. Influenza-Virus zu retten Transfektion Influenza A-Virus gehört zur Familie der Orthomyxoviridae negativen RNA-umhüllte Viren. Das Influenza-A-Virus-Genom besteht aus acht verschiedenen RNA-Gene von negativer Polarität, dass codieren mindestens 4 11 virale Proteine ​​(Abbildung 1). Wir konzentrieren wird, in diesem Bericht über die Rettung eines der am häufigsten Laborstamm, Influenza A/PR/8/34, 5 mit AmbiSense Plasmide (PDZ) mit der 8 Influenza A/PR/...

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Rettung von rekombinanten Influenza-Viren von Plasmid-DNA ist ein einfacher und unkomplizierter Vorgang, sobald das Protokoll routinemäßig im Labor durchgeführt, aber am Anfang, mehrere Dinge schief gehen kann. Es ist zwingend notwendig, um gute Plasmidpräparation haben, um das Virus zu erzeugen. Die richtige Wartung der Zelllinien (293T und MDCK) ist entscheidend für eine erfolgreiche virale retten. Traditionell ist eine genetische Tag in einer Influenza-Gen-kodierenden Plasmid eingefügt, durch stille Mutagenese....

Zell-Linien 293T (Katalog-Nummer CRL-11268) und MDCK (Katalog-Nummer CCL-34)-Zelllinien werden in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 in DMEM 10% FBS, 1% PS erhalten. Die Zellen sind erhältlich Form der American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). Bebrüteten Hühnereiern Embryonierte 10-Tage alten Hühnereiern können von Charles River Laboratories, specific pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Produkte und Dienstleistungen bezogen werden. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Die Eier werden bei 37 ° C vor und nach der viralen Infektion inkubiert. Vor und nach der Virusinfektion, Eier durchleuchtet, um die Lebensfähigkeit der Embryonen zu bestimmen. Es ist sehr wichtig für tote Eier vor und nach der Virusinfektion zu suchen. Vor der Infektion ein totes Ei kann leicht durch das Fehlen der Blutgefäße sowie das Fehlen von Embryos Mobilität beobachtet werden. Wenn candled, bewegen lebenden Embryos. Nach Virusinfektion ein totes Ei (wahrscheinlich Influenzavirus-Infektion im Zusammenhang) wird leicht durch die schlechte Aussehen des Eies als von den kleineren und blutigen Volumen von Allantoisflüssigkeit gesehen gesichtet werden. Infizierte-Eier sind in Doppel autoklavierbar Taschen verworfen und autoklaviert folgenden Standardverfahren. Huhn roten Blutkörperchen (RBC) Huhn RBC aus Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, MD 21620 gekauft werden. Lagerung bei 4 ° C. Für HA-Assays, waschen 5 ml des Huhns RBC mit 45 ml PBS 1X in einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 1000 rpm, RT. Entsorgen Sie sorgfältig den Überstand und die Nutzung einer 1:1000 Verdünnung des pelletierten RBC in PBS 1X (Endkonzentration von 0,5-1,0% RBC). Tissue Kulturüberständen und Allantois Flüssigkeiten Beide, Gewebe Kulturüberständen und Allantois Flüssigkeiten können bei 4 ° C gelagert werden für eine kurze Zeit. Nach der Bestätigung Virus zu retten, sind Viren aus der Zelle Überstände oder Allantoisflüssigkeit bei -80 ° C gelagert Plasmide Alle Plasmide sind bereit, mit einem Plasmid Maxi Kit nach den Empfehlungen des Herstellers. Alle Plasmide sind Aliquot bei Konzentrationen von 1 pg / ml in ddH 2 O und bei -20 ° C. Für kurzfristige Lagerung kann das Plasmid bei 4 ° C zu halten sein Die Konzentration des gereinigten DNA-Plasmid wird durch Spektrophotometrie bei 260 nm bestimmt, mit der Reinheit wird unter Verwendung der 260:280 nm-Verhältnis. Zubereitungen mit 1,8 bis 2,0 260:280 nm Verhältnisse gelten für angeeignet Virus zu retten Zwecke. Darüber hinaus sollte das Plasmid Konzentration und Reinheit mit Agarosegel-Chromatographie bestätigt werden. AmbiSense PDZ Plasmide (6) mit den acht Influenza A/PR/8/34 viralen Gene (7) sind in Abbildung 2 dargestellt. Viren Das beschriebene Protokoll zur Rettung Influenza A/PR/8/34 finden Sie unter Sicherheitsstufe (BSL) 2 Bedingungen durchgeführt werden. Kontaminiertem Material, einschließlich Gewebe Kulturüberständen und bebrüteten Eiern, sollte vor der Entsorgung sterilisiert werden. Rettung von anderen Influenza-Viren können höhere BSL Bedingungen und daher besondere Bedingungen / security Messungen müssen befolgt werden. Gewebekultur-Medien und Lösungen DMEM 10% FBS 1% PS: 445 ml Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 50 ml Fetal Bovine Serum (FBS), und 5 ml 100X Penicillin / Streptomycin (PS). Lagerung bei 4 ° C. Diese Medien werden verwendet, um 293T und MDCK-Zellen als auch für die Transfektionen aufrecht zu erhalten. DMEM 0,3% BA 1% PS: 495,7 ml DMEM, 4,3 ml 35% Rinderalbumin (BA). Lagerung bei 4 ° C. Kurz bevor zu verwenden, fügen TPCK behandelt Trypsin, um eine endgültige Konzentration von 1 ug / ml. Infektiöse Medien. 10X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS): 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g KH 2 PO 4. Add ddH 2 O auf 1 Liter auffüllen. Der pH-Wert auf 7,3. Sterilisieren im Autoklaven. Lagerung bei Raumtemperatur. 1X PBS: 10x PBS im Verhältnis 1:10 mit ddH 2 O. Sterilisieren im Autoklaven und bei Raumtemperatur lagern.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Die Bemühungen durch eine Reihe von Influenza Forschergruppen haben maßgeblich an der Entwicklung und Verbesserung von Influenza A-Virus durch reverse Genetik. Ursprünglich im Jahr 1999 gegründet<sup&gt; 1,2</sup&gt; Plasmid-basierte reverse genetische Techniken zur rekombinanten Viren zu erzeugen revolutioniert haben die Influenza-Forschungsfeld, weil bestimmte Fragen durch gentechnisch veränderte, infektiöse, rekombinante Influenza-Viren bereits beantwortet wurden. Solche Studien sind die Virusreplikation, Funktion von viralen Proteinen, den Beitrag der spezifischen Mutationen in der viralen Proteine ​​in viralen Replikation und / oder Pathogenese und auch, mittels viraler Vektoren rekombinante Influenza-Viren Expression fremder Proteine<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Rettung von Influenza A-Viren von Plasmid-DNA ist eine grundlegende und wichtige experimentelle Technik, die Influenza-Forscher an rekombinanten Viren zu erzeugen, um mehrere Aspekte in der Biologie des Influenza-Virus zu untersuchen und als potentielle Vektoren oder Impfstoffe verwendet werden können.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Tücher für Influenza-A-Virus-Erkennung und Isolierung von Schweine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...