Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

המחברים רוצה להודות לחברי בעבר ובהווה של אדולפו גרסיה-סאסטרה ופיטר Palese מעבדות לפיתוח טכניקות שפעת הפוך גנטיקה פלסמידים. מחקר AG-S מעבדות ממומנת בחלקה על ידי נכה, מרכז NIAID במימון מצוינות למחקר שפעת ומעקב (HHSN266200700010C) וכן על ידי מענקים NIAD R01AI046954, U01AI070469 ו P01AI058113. מחקר LM-S מעבדה ממומנת חלקית על ידי מענק NIAID RO1AI077719.

1. הצלה וירוס שפעת transfection נגיף שפעת שייך למשפחת Orthomyxoviridae שלילי של גדילי RNA וירוסים אפוף. שפעת A בגנום הנגיף מורכב משמונה גנים שונים של RNA קוטביות שלילית המקודדים, לפחות, 11 חלבונים נגיפיים (איור 1) 4. אנו נתמקד, בדוח זה, על חילו...

<ol>
	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

ההצלה של נגיפי שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד הוא תהליך פשוט וברור פעם פרוטוקול מבוצע באופן שגרתי במעבדה, אבל בהתחלה, דברים רבים יכולים להשתבש. זה הכרחי להיות הכנה טובה פלסמיד כדי ליצור את הנגיף. תחזוקה נכונה של שורות תאים (293T ו MDCK) הוא חיוני להצלת ויראלי מוצלח. באופן מסור?...

שורות תאים 293T (מספר קטלוג CRL-11268) ו MDCK (מספר קטלוג CCL-34) שורות תאים נשמרות 37 ° C חממה עם 5 CO 2% DMEM 10% FBS, PS 1%. תאים הם צורה זמין סוג התרבות האמריקאית אוסף (ATCC, 10801 אוניברסיטת שדרות, Manassas, VA. 20110-2209 ארה&quot;ב). עוף וביצים Embryonated Embryonated 10 יום בן ביצי תרנגולת ניתן לקבל צ&#39;ארלס ריבר מעבדות, העופות ספציפי פתוגן אגרת התשלום (SPAFAS) העופות מוצרים ושירותים. פרנקלין מלאי, 106 כביש 32, צפון פרנקלין, CT 06254 ארה&quot;ב. ביצים מודגרת ב 37 ° C הקודמת ואחרי זיהום ויראלי. לפני ואחרי זיהום ויראלי, בדק את הביצים כדי לקבוע את הכדאיות של העוברים. חשוב מאוד לחפש ביצים מת לפני ואחרי זיהום ויראלי. לפני זיהום ביצה מת ניתן הבחין בקלות על ידי בהעדר כלי הדם, כמו גם העדר ניידות העובר. כאשר בדק את, עוברים לגור לזוז. לאחר זיהום ויראלי ביצה מת (כנראה קשור זיהום בנגיף שפעת) יהיה הבחין בקלות על ידי הופעתו של ביצה רע כפי שהוא נראה על ידי נפח קטן של נוזל דם allantoic. אינפקטד, ביצים מושלכות בשקיות autoclavable כפול autoclaved הבאים נהלים סטנדרטיים. עוף אדום דם תאים (RBC) עוף RBC ניתן לרכוש חוות Truslow, 201 כביש בעמק, Chestertown, MD 21620. חנות ב 4 ° C. עבור מבחני HA, לשטוף 5 מ&quot;ל של RBC עוף עם 45 מ&quot;ל של PBS 1X בצינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1000 rpms, RT. מחק בזהירות את supernatant ולהשתמש דילול 1:1000 של RBC pelleted ב PBS 1X (הריכוז הסופי של RBC 0.5-1.0%). תרבות רקמות ונוזלים supernatants allantoic שניהם, תרבות supernatants רקמות ונוזלים allantoic ניתן לאחסן 4 ° C למשך תקופה קצרה של זמן. לאחר אישור הצלה וירוס, וירוסים supernatants תא או נוזל allantoic מאוחסנים ב -80 ° C. פלסמידים כל פלסמידים מוכנים באמצעות המלצות maxi פלסמיד ערכת הבא של היצרן. פלסמידים כל aliquot בריכוזים של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ב DDH 2 O ו המאוחסן ב -20 ° C. עבור אחסון לטווח קצר, פלסמיד ניתן לשמור על 4 ° C. הריכוז של ה-DNA פלסמיד מטוהרים נקבעת על ידי לספקטרופוטומטריה ב 260 ננומטר, עם טוהר להיות מוערך באמצעות יחס 260:280 ננומטר. תכשירים עם 260:280 יחס 1.8-2.0 ננומטר נחשבים הופקע למטרות הצלה וירוס. בנוסף, ריכוז טוהר פלסמיד ויש אישר agarose עם ג&#39;ל כרומטוגרפיה. Ambisense pDZ פלסמידים (6) המכיל שמונה שפעת A/PR/8/34 גנים ויראליים (7) הן באיור 2. וירוסים הפרוטוקול המתואר להצלת שפעת A/PR/8/34 יכול להתבצע תחת biosafety רמה (מנהלת הליגה) 2 תנאים. חומר מזוהם, כולל תרבות supernatants רקמות ביצים embryonated, יש לעקר לפני סילוק. ההצלה של וירוס השפעת אחרים עשויים לדרוש תנאים מנהלת הליגה גבוהה יותר, ולכן, תנאים מיוחדים / מדידות הביטחון יהיה צורך אחר. תרבות רקמות התקשורת ופתרונות DMEM 10% FBS PS 1%: 445 מ&quot;ל מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM), 50 מ&quot;ל של סרום שור עוברית (FBS), ו - 5 מ&quot;ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין (PS). חנות ב 4 ° C. מדיה זה ישמש כדי לשמור על התאים 293T ו MDCK וכן transfections. DMEM BA 0.3% 1% נ.ב.: 495.7 מ&quot;ל של DMEM, 4.3 מ&quot;ל של 35% שור אלבומין (BA). חנות ב 4 ° C. רק לפני השימוש, מוסיפים טריפסין TPCK שטופלו לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. זיהומיות התקשורת. פוספט 10X שנאגרו מלוחים (PBS): 80 גרם של NaCl, 2 גרם של KCl, 11.5 גרם של Na 2 HPO 4 0.7 H 2 O, 2 גרם של KH 2 PO 4. הוסף DDH 2 O עד 1 ליטר. התאם ל-pH 7.3. לעקר ידי החיטוי. אחסן בטמפרטורת החדר. 1X PBS: 10X PBS לדלל 1:10 עם DDH 2 O. לעקר ידי החיטוי ולאחסן בטמפרטורת החדר.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

מאמצים על ידי מספר קבוצות מחקר שפעת כבר מרכזי פיתוח ושיפור של שפעת A גנטיקה הפוכה וירוס. הוקמה במקור בשנת 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; פלסמיד טכניקות מבוססות גנטית הפוכה לייצר וירוסים רקומביננטי חוללו מהפכה בתחום המחקר שפעת בגלל שאלות ספציפיות כבר ענה על ידי הנדסה גנטית, וירוסים זיהומיות שפעת רקומביננטי. מחקרים אלה כוללות שכפול הנגיף, פונקציה של חלבונים נגיפיים, התרומה של מוטציות ספציפיות חלבונים נגיפיים שכפול נגיפי ו / או בפתוגנזה ו, גם, וקטורים ויראליים באמצעות נגיפי שפעת רקומביננטי לבטא חלבונים זרים<sup&gt; 3</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

הצלה של שפעת וירוסים מ-DNA פלסמיד היא טכניקה ניסויית בסיסי וחיוני המאפשר לחוקרים שפעת לייצר וירוסים רקומביננטי ללמוד היבטים מרובים הביולוגיה של נגיף השפעת, וכן לשמש וקטורים או חיסונים פוטנציאליים.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...