Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
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लेखकों गार्सिया Sastre Adolfo और पीटर Palese प्रयोगशालाओं में इन्फ्लूएंजा रिवर्स आनुवंशिकी तकनीक और plasmids के विकास के लिए अतीत और वर्तमान सदस्यों को शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. एजी-एस प्रयोगशालाओं में अनुसंधान CRIP, इन्फ्लुएंजा अनुसंधान और निगरानी के लिए एक NIAID वित्त पोषित की उत्कृष्टता केंद्र (HHSN266200700010C) के द्वारा आंशिक रूप से और NIAD R01AI046954 अनुदान, U01AI070469 और P01AI058113 द्वारा वित्त पोषित है. LM-S प्रयोगशाला में अनुसंधान आंशिक रूप से NIAID RO1AI077719 अनुदान द्वारा वित्त पोषित है.

1. इन्फ्लुएंजा वायरस बचाव अभिकर्मक इन्फ्लुएंजा ए वायरस Orthomyxoviridae नकारात्मक असहाय आरएनए छा वायरस के परिवार के अंतर्गत आता है है . इन्फ्लूएंजा ए वायरस जीनोम आठ नकारात्मक polarity के विभिन्न आरएनए ज?...

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

प्लास्मिड डीएनए से पुनः संयोजक इन्फ्लूएंजा वायरस के बचाव एक बार प्रोटोकॉल नियमित रूप से प्रयोगशाला में किया जाता है एक सरल और सीधा प्रक्रिया है, लेकिन शुरुआत में, कई बातें गलत जा सकते हैं. यह आवश्यक है ?...

सेल लाइनों कैटलॉग (संख्या CRL - 11,268) 293T और MDCK कैटलॉग (संख्या सीसीएल-34) सेल लाइनों DMEM 10% FBS, 1% पुनश्च में 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जाता है . कक्ष उपलब्ध फार्म अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (ATCC, 10801 विश्वविद्यालय Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 संयुक्त राज्य अमेरिका.) कर रहे हैं. Embryonated चिकन अंडे Embryonated 10 दिन पुरानी चिकन अंडे चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं, विशिष्ट पैथोजन शुल्क एवियन (SPAFAS) आपूर्ति एवियन उत्पाद और सेवा से प्राप्त किया जा सकता है. फ्रेंकलिन कॉमन्स, 106 32 का उत्तर फ्रेंकलिन, सीटी 06254 संयुक्त राज्य अमेरिका. अंडे 37 ° पूर्ववर्ती सी और वायरल संक्रमण के बाद incubated हैं. वायरल संक्रमण के पहले और बाद में, अंडे भ्रूण की व्यवहार्यता का निर्धारण candled हैं. यह बहुत महत्वपूर्ण है कि वायरल संक्रमण के पहले और बाद में मृत अंडे के लिए देखो. संक्रमण से पहले एक मरे हुए अंडे आसानी से रक्त वाहिकाओं के अभाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भ्रूण गतिशीलता के अभाव के द्वारा देखा जा सकता है है. जब candled, जीना भ्रूण चाल है. वायरल संक्रमण के बाद एक मरे हुए अंडे (शायद इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण से संबंधित) allantoic तरल पदार्थ के छोटे और खूनी मात्रा द्वारा देखा के रूप में अंडे का बुरा उपस्थिति द्वारा आसानी से देखा जाएगा. संक्रमित अंडे डबल Autoclavable बैग में खारिज कर रहे हैं और मानक प्रक्रियाओं का पालन autoclaved हैं. चिकन लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) चिकन आरबीसी Truslow फार्म, 201 घाटी रोड, Chestertown, 21,620 के प्रबंध निदेशक से खरीदा जा सकता है. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस हा assays के लिए, एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 45 मिलीलीटर पीबीएस 1X के साथ चिकन आरबीसी के 5 मिलीलीटर धो लो. 1000 rpms, आरटी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस 1X में pelleted आरबीसी के 1:1000 कमजोर पड़ने (0.5-1.0% आरबीसी के अंतिम एकाग्रता) का उपयोग करें. टिशू कल्चर supernatants और allantoic तरल पदार्थ दोनों, टिशू कल्चर supernatants और allantoic तरल पदार्थ 4 बजे डिग्री सेल्सियस समय की एक छोटी अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है. वायरस के बचाव की पुष्टि करने के बाद, सेल supernatants या allantoic द्रव से वायरस -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कर रहे हैं प्लास्मिड सभी plasmids एक प्लाज्मिड मैक्सी किट निम्नलिखित निर्माता की सिफारिशों का उपयोग करने के लिए तैयार हैं. सभी plasmids μg 1 / एमएल की सांद्रता में DDH 2 हे में विभाज्य हैं और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अल्पकालिक भंडारण के लिए, 4 में प्लाज्मिड रखने जा सकता डिग्री सेल्सियस शुद्ध प्लास्मिड डीएनए की एकाग्रता 260 एनएम spectrophotometry द्वारा निर्धारित किया जाता है, शुद्धता 260:280 एनएम अनुपात का उपयोग कर अनुमान किया जा रहा है के साथ. 1.8-2.0 260:280 एनएम अनुपात के साथ तैयारी पर विचार कर रहे हैं वायरस बचाव प्रयोजनों के लिए विनियोजित. इसके अतिरिक्त, प्लाज्मिड एकाग्रता और पवित्रता agarose जेल क्रोमैटोग्राफी के साथ पुष्टि की जानी चाहिए. Ambisense pDZ (6) plasmids आठ इन्फ्लूएंजा A/PR/8/34 वायरल जीनों (7) से युक्त चित्रा 2 में सचित्र हैं. वायरस A/PR/8/34 इन्फ्लूएंजा बचाव के लिए में वर्णित प्रोटोकॉल जैव सुरक्षा (BSL) स्तर 2 शर्तों के तहत किया जा सकता है है. दूषित टिशू कल्चर supernatants और embryonated अंडे सहित सामग्री, निपटान से पहले निष्फल होना चाहिए. अन्य इन्फ्लूएंजा वायरस के बचाव उच्च BSL शर्तों और इसलिए, विशेष परिस्थितियों / सुरक्षा मापन के लिए पीछा किया जाना चाहिए की आवश्यकता हो सकती है. टिशू कल्चर मीडिया और समाधान 445 मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल (DMEM) मध्यम, भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 50 मिलीलीटर, और 100X पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी एस) के 5 मिलीलीटर: DMEM 10% FBS% 1 पी एस. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस यह मीडिया transfections लिए 293T और MDCK के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. DMEM 0.3% बीए 1% पुनश्च: DMEM के 495.7 मिलीलीटर, 35% गोजातीय albumin (बीए) के 4.3 मिलीलीटर. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस बस का उपयोग करने से पहले, 1 μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता TPCK इलाज trypsin जोड़ें. संक्रामक मीडिया. NaCl के 80 ग्राम, KCl के 2 जी, ना 2 4 HPO 0.7 एच 2 हे, 2 के.एच. के 2 जी 4 पीओ के 11.5 ग्राम: 10X फास्फेट (पीबीएस) खारा buffered. 1 लीटर DDH 2 हे जोड़ें. 7.3 पीएच को समायोजित करें. आटोक्लेव द्वारा जीवाणुरहित. कमरे के तापमान पर स्टोर. 1X पीबीएस: पतला DDH 2 ओ के साथ 10X पीबीएस 1:10 आटोक्लेव और कमरे के तापमान पर दुकान से जीवाणुरहित.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

इन्फ्लूएंजा अनुसंधान समूहों की एक संख्या से प्रयास और एक इन्फ्लूएंजा वायरस रिवर्स आनुवंशिकी के विकास में सुधार में निर्णायक किया गया है. मूलतः 1999 में स्थापित<sup1,2&gt;</sup&gt; प्लाज्मिड आधारित रिवर्स आनुवंशिक पुनः संयोजक वायरस उत्पन्न तकनीक इन्फ्लूएंजा अनुसंधान के क्षेत्र में क्र ांतिकारी परिवर्तन किया है क्योंकि विशिष्ट सवालों के अनुवांशिक इंजीनियर, संक्रामक, पुनः संयोजक इन्फ्लूएंजा वायरस से जवाब दिया गया है. इस तरह के अध्ययन वायरस प्रतिकृति, वायरल प्रोटीन के समारोह, वायरल प्रतिकृति और / या रोगजनन में वायरल प्रोटीन में विशिष्ट परिवर्तन के योगदान और, भी, वायरल vectors रीकॉम्बीनैंट इन्फ्लूएंजा विदेशी प्रोटीन व्यक्त वायरस का उपयोग शामिल<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

प्लास्मिड डीएनए से इन्फ्लूएंजा ए वायरस के बचाव एक बुनियादी और आवश्यक प्रयोगात्मक तकनीक है कि इन्फ्लूएंजा शोधकर्ताओं उत्पन्न करने के लिए पुनः संयोजक वायरस इन्फ्लूएंजा वायरस के जीव विज्ञान में कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए, और संभावित वैक्टर या टीके के रूप में इस्तेमाल किया जा अनुमति देता है.

पुनः संयोजक इन्फ्लुएंजा वायरस के डीएनए प्लाज्मिड से पीढ़ी

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

इन्फ्लुएंजा वायरस के लिए उच्च throughput जांच विधि

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

संक्रमित कोशिकाओं की Chromatin से इन्फ्लुएंजा वायरस Ribonucleoprotein के परिसर संबंध शुद्धीकरण

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

सीडीएनए से संयोजक न्यूकासल रोग वायरस का बचाव

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग उपन्यास H7N9 इन्फ्लूएंजा वायरस से कार्यात्मक संयोजक Hemagglutinin और neuraminidase प्रोटीन की अभिव्यक्ति

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Embryonated चिकन अंडे में इन्फ्लुएंजा वायरस प्रचार

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Chimeric माउस मॉडल में संयोजक फ्लू के टीके की intranasal प्रशासन mucosal प्रतिरक्षण अध्ययन करने के लिए

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

अमर छाँटे बी कोशिकाओं से पुनः संयोजक मानव आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का सृजन

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

स्वाइन से इन्फ्लुएंजा ए वायरस का पता लगाने और अलगाव के लिए नाक पोंछे

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

ढाल centrifugation द्वारा इन्फ्लुएंजा एक वायरस capsids की इन विट्रो disassembly में

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

एक नई दुनिया Zika वायरस संक्रमित क्लोन से पुनः संयोजक वायरस के बचाव और विशेषता

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...