Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
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Gli autori desiderano ringraziare i membri passati e presenti nel Adolfo García-Sastre e Peter Palese laboratori per lo sviluppo di tecniche di reverse influenza genetica e plasmidi. La ricerca in laboratori di AG-S è parzialmente finanziato dalla CRIP, un NIAID-finanziato Centro di Eccellenza per la Ricerca e la sorveglianza dell&#39;influenza (HHSN266200700010C) e da sovvenzioni NIAD R01AI046954, U01AI070469 e P01AI058113. La ricerca in laboratorio LM-S è parzialmente finanziato dal NIAID concedere RO1AI077719.

1. Virus influenzale trasfezione di soccorso Influenza A virus appartiene alla famiglia delle Orthomyxoviridae negativo-stranded RNA virus avvolto. Il genoma del virus influenzale A si compone di otto geni diversi RNA di polarità negativa che codificano, almeno, 11 proteine ​​virali (Figura 1) 4. Ci concentreremo, in questa relazione, il salvataggio di uno dei ceppo di laboratorio più comuni, l&#39;influenza A/PR/8/34, 5 usando plasmidi ambisense (PDZ) cont...

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Salvataggio dei virus influenzali ricombinante da DNA plasmidico è un processo semplice e lineare una volta che il protocollo è eseguita di routine in laboratorio, ma in principio, più cose possono andare storte. E &#39;indispensabile avere una buona preparazione plasmide per generare il virus. La corretta manutenzione delle linee cellulari (293T e MDCK) è fondamentale per un salvataggio di successo virale. Tradizionalmente, un tag genetico viene inserito in una influenza gene codifica plasmide, da mutagenesi silenz...

Linee cellulari 293T (numero di catalogo CRL-11268) e MDCK (numero di catalogo CCL-34) linee di cellule sono mantenute in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Le cellule vengono modulo disponibile l&#39;American Type Culture Collection (ATCC, 10801 Università Boulevard, Manassas, in Virginia. 20110-2209 USA). Uova embrionate di pollo Embrionate di 10 giorni di età uova di pollo può essere ottenuto da Charles River Laboratories, organismi patogeni specifici di alimentazione aviaria Fee (SPAFAS) aviaria Prodotti e Servizi. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Le uova vengono incubate a 37 ° C precedente e dopo l&#39;infezione virale. Prima e dopo l&#39;infezione virale, le uova sono candled a determinare la vitalità degli embrioni. E &#39;molto importante per cercare le uova morti prima e dopo l&#39;infezione virale. Prima dell&#39;infezione un uovo morto può essere facilmente individuato per l&#39;assenza di vasi sanguigni così come l&#39;assenza di mobilità dell&#39;embrione. Quando esaminate, embrioni vivi movimento. Dopo l&#39;infezione virale un uovo morto (probabilmente correlati all&#39;infezione da virus influenzale) sarà facilmente individuato dalla comparsa cattiva dell&#39;uovo come si vede dal volume più piccolo e sanguinario di liquido allantoico. Infetti-uova vengono scartati in due sacchetti autoclavabili e sterilizzati in autoclave seguendo le procedure standard. Pollo globuli rossi (RBC) Pollo RBC possono essere acquistati presso Fattorie Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, MD 21620. Conservare a 4 ° C. Per i saggi di HA, lavare 5 ml di globuli rossi di pollo con 45 ml di PBS 1X in un tubo da centrifuga da 50 ml. Centrifugare per 5 minuti a 1000 rpm, RT. Scartare con attenzione il sopranatante e utilizzare una diluizione 1:1000 del RBC pellet in PBS 1X (concentrazione finale del 0.5-1.0% RBC). Tessuti e fluidi sovranatanti allantoideo Entrambi, surnatanti colture di tessuti e fluidi allantoideo può essere conservato a 4 ° C per un breve periodo di tempo. Dopo aver confermato di soccorso virus, virus da surnatanti di cellule o liquido allantoico sono conservati a -80 ° C. Plasmidi Tutti i plasmidi sono preparati con le raccomandazioni di un plasmide produttore di kit maxi successivo. Tutti i plasmidi sono aliquota a concentrazioni di 1 mg / ml in DDH 2 O e conservati a -20 ° C. Per la conservazione a breve termine, il plasmide si può mantenere a 4 ° C. La concentrazione del DNA plasmidico purificato è determinata dalla spettrofotometria a 260 nm, con purezza di essere stimato utilizzando il rapporto 260:280 nm. Preparazioni a 1,8-2,0 260:280 rapporti nm sono considerati appropriati per operazioni di ripristino del virus. Inoltre, la concentrazione e la purezza plasmide deve essere confermata con gel cromatografia. Ambisense PDZ plasmidi (6) contenente l&#39;influenza otto A/PR/8/34 geni virali (7) sono illustrati nella Figura 2. Virus Il protocollo descritto per il salvataggio influenza A/PR/8/34 può essere effettuata sotto il livello di biosicurezza (BSL) 2 condizioni. Materiali contaminati, comprese sovranatanti tessuti e uova embrionate, devono essere sterilizzati prima dello smaltimento. Salvataggio del virus dell&#39;influenza altri possono esigere condizioni BSL superiore e, di conseguenza, le condizioni speciali / misure di sicurezza dovranno essere seguite. Terreni di coltura dei tessuti e soluzioni DMEM 10% FBS 1% PS: 445 ml di Dulbecco modificato Eagle medium (DMEM), 50 ml di siero fetale bovino (FBS), e 5 ml di 100X penicillina / streptomicina (PS). Conservare a 4 ° C. Questo supporto sarà utilizzato per mantenere le cellule 293T e MDCK così come per la transfezione. DMEM BA 0,3% 1% PS: 495,7 ml di DMEM, 4,3 ml di 35% di albumina bovina (BA). Conservare a 4 ° C. Appena prima dell&#39;uso, aggiungere tripsina TPCK trattati per una concentrazione finale di 1 mg / ml. Mezzi di comunicazione infettivi. Fosfato 10X soluzione salina tamponata (PBS): 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 11,5 g di Na 2 HPO 4 0,7 H 2 O, 2 g di KH 2 PO 4. Aggiungi DDH 2 O fino a 1 litro. Regolare il pH a 7,3. Sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente. PBS 1X: Diluire 10X PBS 1:10 con DDH 2 O. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Gli sforzi da una serie di gruppi di ricerca sono stati influenzali fondamentale per lo sviluppo e il miglioramento della genetica del virus dell&#39;influenza A inversa. Originariamente fondata nel 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; Le tecniche di reverse plasmide basato genetica per creare virus ricombinanti hanno rivoluzionato il campo della ricerca, perché l&#39;influenza specifiche domande hanno avuto risposta da parte geneticamente modificati, infettive, virus influenzali ricombinanti. Tali studi includono la replicazione del virus, la funzione delle proteine ​​virali, il contributo di specifiche mutazioni nelle proteine ​​virali in replicazione virale e / o patogenesi e, anche, vettori virali con virus influenzali ricombinanti che esprimono proteine ​​estranee<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Salvataggio di virus dell&#39;influenza A dal DNA plasmide è una tecnica di base ed essenziale sperimentale che consente ai ricercatori di generare virus influenzali ricombinanti per studiare i molteplici aspetti della biologia del virus dell&#39;influenza, e da utilizzare come potenziali vettori o vaccini.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Espressione dei funzionali ricombinante emoagglutinina e neuraminidasi proteine ​​del virus Novel H7N9 Influenza utilizzando l&#39;espressione sistema Baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Panni nasale per l&#39;influenza A rilevazione antivirus e isolamento da Suina

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...