Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

著者らは、インフルエンザの逆遺伝学技術とプラスミドの開発のためのアドルフォガルシア、サストレとピーターPaleseの研究室で過去と現在のメンバーに感謝したいと思います。 AG - Sの研究室で研究の一部は手足の不自由な人、インフルエンザの研究と監視のための優秀NIAID資金によるセンター（HHSN266200700010C）によっておよび大学評価学位授与機構の助成金R01AI046954、U01AI070469とP01AI058113によって賄われています。 LM - Sのラボの研究は、部分的にNIAIDの助成金RO1AI077719によって運営されている。

1。インフルエンザウイルスの救助のトランスフェクションインフルエンザウイルスは、負の鎖RNAエンベロープウイルスのオルトミクソウイルス科のファミリーに属する。インフルエンザは、ウイルスゲノムは、少なくとも、11のウイルスタンパク質（図1）4をエンコードする負極性の8種類のRNAの遺伝子で構成されています。我々は（8インフルエンザA/PR/8/34?...

<ol>
	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

プラスミドDNAから組換えインフルエンザウイルスの救助は、プロトコルが日常的に実験室で実施されると、シンプルかつ簡単なプロセスですが、初めに、複数の物事が間違って行くことができます。それは、ウイルスを生成するために適切なプラスミド調製を持つことが不可欠です。細胞株（293TとMDCK）の適切な維持管理が成功したウイルスの救助のための非常に重要です。伝統的に、遺伝?...

細胞株 293T（カタログ番号CRL - 11268）およびMDCK（カタログ番号CCL - 34）の細胞株をDMEM 10％FBS、1％PSで、5％CO 2で37℃のインキュベーター中で維持されます。細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、10801ユニバーシティブールバード、マナッサス、バージニア州。20110〜2209、アメリカ）利用可能なフォームです。 孵化鶏卵孵化10日齢の鶏の卵は、チャールズリバー研究所、特定の病原体手数料鳥サプライ（SPAFAS）鳥製品とサービスから得ることができる。フランクリンコモンズ、106ルート32、ノースフランクリン、CT 06254、米国。卵は、° C前後のウイルス感染後に37℃でインキュベートする。ウイルス感染前と後、卵は、胚の生存性を決定するためにcandledされています。それは、ウイルス感染前と後に死んだ卵を探すことが非常に重要です。感染する前に死んだ卵は、簡単に血管の欠如だけでなく、胚の移動性の欠如を見破ることができます。 candledときは、ライブ胚が移動する。ウイルス感染後に死んだ卵は、（おそらくインフルエンザウイルスの感染に関係する）簡単に尿膜腔液の小さい方と流血の量によって見られるように卵の外観不良が発見されます。感染の卵は、二重オートクレーブバッグに破棄され、標準的な手順は、次のオートクレーブ処理されています。 ニワトリ赤血球（RBC） ニワトリ赤血球はTruslowファーム、201バレーロード、チェスター、MD 21620から購入することができます。 4℃で保存します。 HAアッセイのために、50 ml遠心チューブにPBS 1X 45mlのチキンRBC 5 mlを洗う。 1000年のrpm、室温で5分間、遠心します。注意深く上清を捨て、PBS 1Xでペレット化RBC（0.5-1.0％RBCの最終濃度）の1:1000希釈を使用してください。 組織培養上清や尿液 、組織培養上清や尿液の両方を4℃で短期間保存することができる。ウイルスの救助を確認した後、細胞上清や尿膜液からのウイルスは、-80℃で保存されていますプラスミドすべてのプラスミドは、メーカーの推奨に従ってプラスミドマキシキットを用いて調製されています。すべてのプラスミドは、のddH 2 Oで1μg/ mlの濃度で分注しており、-20℃で保存短期記憶のために、プラスミドは4で維持することができます℃を精製プラスミドDNAの濃度は純度が260:280 nmの比を用いて推定されていると、260 nmでの分光光度法により決定されます。 1.8から2.0 260:280 nmの比率を持つ準備がウイルスの救助の目的のために充当とみなされます。さらに、プラスミド濃度および純度は、アガロースゲルクロマトグラフィーで確認してください。 Ambisense PDZプラスミド（6）8つのインフルエンザA/PR/8/34ウイルス遺伝子（7）を含む、図2に示します。 ウイルスインフルエンザA/PR/8/34を救出するために記述されているプロトコルは、バイオセーフティーレベル（BSL）2の条件下で行うことができます。組織培養上清および孵化卵を含む汚染物質は、廃棄前に滅菌する必要があります。他のインフルエンザウイルスの救助は、より高いBSL条件を必要とし、従って、特別な条件/セキュリティ測定が続いする必要があります。 組織培養培地およびソリューション DMEM 10％FBS 1パーセントPS：445ミリリットルダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FBS）を50ml、および100Xペニシリン/ストレプトマイシン（PS）5mlの。 4℃で保存します。このメディアは、トランスフェクションのためだけでなく、293TとMDCK細胞を維持するために使用されます。 DMEM 0.3％BA 1パーセントPS：DMEMの495.7ミリリットル、35％ウシアルブミン（BA）の4.3ミリリットル。 4℃で保存します。使用直前に、1μg/ mlの終濃度にTPCK処理されたトリプシンを追加する。感染媒体。 塩化ナトリウム80gの、塩化カリウム2gを、のNa 2 HPO 4 · 7H 2 O、KH 2 2gのPO 4の11.5グラム：10Xリン酸緩衝食塩水（PBS）。最大1リットルのddH 2 Oを追加。 7.3にpHを調整する。オートクレーブで滅菌。室温で保管してください。 1X PBS：のddH 2 Oで希釈し、10 × PBS午前1時10分室温でオートクレーブや店舗によって滅菌する。

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

インフルエンザ研究グループの数による努力はインフルエンザウイルスの逆遺伝学の発展と向上に極めて重要なされている。もともと1999年に設立さ<sup&gt; 1,2</sup具体的な質問は、遺伝子組み換え、感染症、組換えインフルエンザウイルスによって応答されているため、組換えウイルスを生成するために&gt;プラスミドベースの逆遺伝学的手法では、インフルエンザの研究分野に革命をもたらしています。このような研究は、ウイルス複製、ウイルスタンパク質の機能、ウイルスの複製および/または病原性のウイルスタンパク質に特異的変異の寄与と、また、外来タンパク質を発現する組換えインフルエンザウイルスを用いてウイルスベクターが含まれています<sup&gt; 3</sup&gt;。

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

プラスミドDNAからのインフルエンザウイルスの救助は、インフルエンザの研究者がインフルエンザウイルスの生物学のさまざまな側面を研究するために組換えウイルスを生成するために、そして潜在的なベクトルまたはワクチンとして使用することを可能にする基本的かつ本質的な実験的な手法です。

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

豚からのインフルエンザAウイルスの検出および単離のための鼻ワイプ

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...