Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

저자는 인플루엔자 역방향 유전학 기술과 plasmids의 발전을위한 아돌포 가르시아 - 사스 트레와 피터 Palese 실험실에서 과거와 현재 회원을 감사드립니다. AG - S 실험실의 연구는 부분적으로 CRIP, 인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 NIAID 투자 센터 (HHSN266200700010C)와 NIAD 보조금 R01AI046954, U01AI070469 및 P01AI058113으로 후원됩니다. LM - S 실험실 연구는 부분적으로 NIAID 부여 RO1AI077719에 의해 후원됩니다.

1. 인플루엔자 바이러스 구조 transfection 인플루엔자 바이러스는 부정적 - 표류하는 RNA 싸여 바이러스의 Orthomyxoviridae 제품군에 속한다. 인플루엔자 바이러스 게놈은 적어도 11 바이러스성 단백질 (그림 1) 4 인코딩 부정 극성의 8 개의 RNA의 유전자로 구성되어 있습니다. 우리는 (8 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 세그먼트를 포함하는 ambisense의 plasmids (pDZ)를 사용하여 ?...

<ol>
	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 구조는 프로토콜이 정기적으로 실험실에서 수행되면 간단하고 간단하게,하지만 처음에 여러 일이 잘못 이동할 수 있습니다. 바이러스를 생성하는 좋은 플라스미드 준비를하기 위해 필수적인 그것을 것입니다. 세포 라인 (293T 및 MDCK)의 적절한 유지 관리는 성공적인 바이러스 구조를 위해 중요합니다. 전통적으로, 유전자 태그는 침묵 돌연변이 유발에 의?...

셀 라인 293T (카탈로그 번호 CRL - 11268) 및 MDCK는 (카탈로그 번호 CCL - 34) 세포 라인 DMEM 10% FBS, 1 % PS에서 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 유지됩니다. 세포는 미국 유형 문화 수집 (ATCC, 10801 유니버 시티대로, 머내서스, VA. 20110-2209 미국) 제공 형태입니다. Embryonated 닭고기 계란 Embryonated 10 일 된 닭 계란은 찰스 리버 연구소 무균 요금 조류 공급 장치 (SPAFAS) 조류 제품 및 서비스에서 얻을 수 있습니다. 프랭클린 커먼스, 106 루트 32, 노스 프랭클린, CT 06254 미국. 계란은 37 ° C 이전에서, 바이러스 감염 후 incubated 수 있습니다. 바이러스 감염 전후, 계란은 배아의 생존을 결정하는 candled 있습니다. 그것은 바이러스 감염 전후에 죽은 알을 찾기 위해 매우 중요합니다. 감염 전에 죽은 계란은 쉽게 혈관의 부재뿐만 아니라 배아 이동성의 부재에 의해 발견하실 수 있습니다. candled 때, 라이브 배아가 이동합니다. 바이러스 감염 후 죽은 계란은 (아마도 독감 바이러스 감염에 관한) 쉽게 allantoic 유체의 작고 피묻은 볼륨으로 볼 수로 계란의 나쁜 모습으로 발견됩니다. 감염 - 달걀은 두 autoclavable 봉투에 삭제 및 표준 절차에 따라 autoclaved 있습니다. 치킨 적혈구 (RBC) 치킨 RBC는 트러 슬로 팜, 201 밸리로드, 체스터, MD 21620에서 구입할 수 있습니다. 4 스토어 ° C. HA의 assays 들어, 50 ML의 원심 분리기 튜브의 PBS 1X 45 ML과 닭고기 RBC 5 ML 씻는다. 1,000 RPM으로, RT에서 5 분 원심 분리기. 신중하게 뜨는을 취소하고 PBS 1X의 pelleted RBC의 1:1000 희석 (0.5-1.0 % RBC의 최종 농도)를 사용합니다. 조직 문화 supernatants 및 allantoic 유체 , 조직 문화 supernatants 및 allantoic 체액 모두 4 ° C 짧은 기간 동안 저장할 수 있습니다. 바이러스 구조를 확인 후, 세포 supernatants 또는 allantoic 유체의 바이러스는 -80 ° C.에 저장됩니다 Plasmids 모든 plasmids은 플라스미드 맥시 키트의 다음 제조 업체의 권장 사항을 사용하여 준비가되어 있습니다. 모든 plasmids은 ddH 2 O 1 μg / ML의 농도에서 나누어지는되며 -20 ° C.에 저장된 단기 스토리지, 플라스미드는 4 유지할 수 있습니다 ° C.를 플라스미드 정화 DNA의 농도는 순도가 260:280 NM 비율을 사용하여 예상되는, 260 NM에서 분광 광도법에 의해 결정됩니다. 1.8-2.0 NM 260:280 비율로 준비가 바이러스 구조 목적 appropriated 간주됩니다. 또한 플라스미드 농도와 순도는 아가로 오스 겔 크로마 토그래피로 확인되어야합니다. Ambisense pDZ plasmids (6) 8 인플루엔자 바이러스 유전자 A/PR/8/34 (7)이있는 그림 2 그림입니다. 바이러스 독감 A/PR/8/34을 구해준 것에 대해 설명하는 프로토콜은 biosafety 수준 (BSL) 2 조건 하에서 수행할 수 있습니다. 조직 문화 supernatants 및 embryonated 계란을 포함한 오염 물질은, 폐기하기 전에 소독한다. 다른 인플루엔자 바이러스의 구조는 높은 BSL 조건 및, 따라서, 특수 조건 / 보안 측정을 소집해야합니다 필요할 수 있습니다. 조직 문화 미디어 및 솔루션 DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS : 445 ML Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM), 태아 소 혈청 (FBS) 50 ML 및 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PS) 5 ML. 4 스토어 ° C. 이 미디어는 transfections에 대한 293T 및 MDCK 세포뿐만 아니라 유지하는 데 사용됩니다. DMEM 0.3 % BA 1퍼센트 PS : DMEM의 495.7 ML, 35% 보빈 알부민 (BA) 4.3 ML. 4 스토어 ° C. 그냥 사용하기 전에, 1 μg / ML의 최종 농도 TPCK 처리 트립신을 추가합니다. 전염성 미디어. NaCl 80 G, KCl 2 G, 나 2 HPO 4 0.7 H 2 O, KH 2 2g PO 4 11.5 g : 10X 인산은 호수 (PBS)를 버퍼. 최대 1리터에 ddH 2 O를 추가합니다. 7.3으로 산도를 조정합니다. 압력솥으로 소독. 상온에서 보관하십시오. 1X PBS : ddH 2 O.로 희석 10X PBS 1시 10분 상온에서 압력솥과 저장에 의해 소독.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

독감 연구 그룹의 숫자로 노력은 인플루엔자 바이러스 역방향 유전학의 개발과 개선에 중요한되었습니다. 원래 1999 년에 설립<sup&gt; 1,2</sup특정 질문이 유전자 조작, 전염성, 재조합 독감 바이러스에 의해 답변 되었기 때문에 재조합 바이러스를 생성하는&gt; 플라스미드 기반의 리버스 유전자 기술은 인플루엔자 연구 분야를 혁명있다. 이러한 연구는 바이러스 복제, 바이러스 단백질의 기능, 바이러스 복제 및 / 또는 pathogenesis에서 바이러스 단백질의 특정 변이의 기여하고, 또한 바이러스성 벡터 외국인 단백질을 표현하는 재조합 독감 바이러스를 사용하여 포함<sup&gt; 3</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

플라스미드 DNA의 인플루엔자 바이러스의 구조는 독감 연구자 인플루엔자 바이러스의 생물학의 여러 측면을 연구하는 재조합 바이러스를 생성하고, 잠재적인 벡터 또는 백신으로 사용할 수있는 기본적인 필수 실험 기법입니다.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

연구

면역학 및 감염병학

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

인간 백신 닭 계란에 인플루엔자 바이러스 전파

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...