Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
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Os autores querem agradecer aos membros do passado e presente na Adolfo García-Sastre e Peter Palese laboratórios para o desenvolvimento de técnicas de genética e reverter influenza plasmídeos. Pesquisa em laboratórios AG-S é parcialmente financiado pelo CRIP, um Centro de NIAID-financiado de Excelência para Pesquisa e Vigilância da Influenza (HHSN266200700010C) e por doações NIAD R01AI046954, U01AI070469 e P01AI058113. Pesquisa em LM-S laboratório é parcialmente financiado pelo NIAID conceder RO1AI077719.

1. Influenza transfecção de resgate de vírus Vírus influenza A pertence à família Orthomyxoviridae de vírus de RNA de fita negativa envolvido. A influenza A genoma do vírus é composto por oito genes diferentes de RNA de polaridade negativa que codificam, pelo menos, 11 proteínas virais (Figura 1) 4. Vamos nos concentrar, neste relatório, sobre o resgate de um dos cepa de laboratório mais comum, a influenza A/PR/8/34, 5 usando plasmídeos ambisense (PD...

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Resgate de vírus influenza recombinante de DNA plasmídeo é um processo simples e direta uma vez que o protocolo é realizada rotineiramente no laboratório, mas no início, várias coisas podem dar errado. É imperativo ter boa preparação plasmídeo para gerar o vírus. Manutenção adequada das linhas celulares (293T e MDCK) é crucial para um resgate bem sucedido viral. Tradicionalmente, uma marca genética é inserido em um gene que codifica a gripe-plasmídeo, por mutagênese em silêncio. Introdução desta mu...

Linhagens de células 293T (número de catálogo CRL-11268) e MDCK (número de catálogo CCL-34) linhas celulares são mantidos em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2 em DMEM 10% FBS, PS 1%. Células são formulário disponível a Coleção American Type Culture (ATCC, 10.801 University Boulevard Manassas, VA. 20110-2209 EUA). Ovos de galinha embrionados Embrionados ovos de 10 dias de idade de frango pode ser obtido a partir de Charles River Laboratories, Abastecimento aviária Specific Pathogen Fee (SPAFAS) Produtos e Serviços aviária. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 EUA. Os ovos são incubados a 37 ° C antes e após a infecção viral. Antes e após a infecção viral, os ovos são candled para determinar a viabilidade dos embriões. É muito importante olhar para os ovos mortos antes e após a infecção viral. Antes da infecção um ovo de mortos pode ser facilmente localizados pela ausência de vasos sanguíneos, bem como a ausência de mobilidade do embrião. Quando candled, embriões vivos movimento. Após a infecção viral um ovo morto (provavelmente relacionado à infecção pelo vírus influenza) vai ser facilmente localizados pela aparência ruim do ovo como visto pelo volume menor e mais sangrenta de líquido alantóico. Infectados de ovos são descartadas em dois sacos autoclaváveis ​​e autoclavada seguintes procedimentos padrão. Células vermelhas do sangue de galinha (RBC) Chicken RBC pode ser comprado de Fazendas Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21.620. Armazenar a 4 ° C. Para ensaios de HA, lavar 5 ml da RBC frango com 45 ml de PBS 1X em um tubo de centrífuga de 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpms, RT. Descartar cuidadosamente o sobrenadante e use uma diluição 1:1000 da RBC peletizada em PBS 1X (concentração final de RBC 0,5-1,0%). Sobrenadantes de cultura de tecidos e fluidos alantóide Ambos, sobrenadantes de cultura de tecidos e fluidos alantóico podem ser armazenados a 4 ° C por um curto período de tempo. Após a confirmação de resgate de vírus, vírus de sobrenadantes de células ou líquido alantóico são armazenadas a -80 ° C. Plasmídeos Todos os plasmídeos são preparadas usando um plasmídeo recomendações maxi fabricante seguinte kit. Todos os plasmídeos são alíquota em concentrações de 1 mg / ml em DDH 2 O e armazenadas a -20 ° C. De curto prazo de armazenamento, o plasmídeo pode ser manter a 4 ° C. A concentração do DNA purificado plasmídeo é determinado por espectrofotometria a 260 nm, com pureza de ser estimada utilizando a proporção nm 260:280. Preparações com 1,8-2,0 nm 260:280 índices são considerados apropriados para fins de resgate de vírus. Além disso, concentração e pureza plasmídeo devem ser confirmados com agarose gel cromatografia. Ambisense PDZ plasmídeos (6) contendo os oito genes da influenza A/PR/8/34 viral (7) são ilustrados na Figura 2. Vírus O protocolo descrito de emergência da gripe A/PR/8/34 pode ser realizada sob nível de biossegurança (BSL) 2 condições. Material contaminado, incluindo sobrenadantes de cultura de tecidos e ovos embrionados, devem ser esterilizados antes da eliminação. Resgate de vírus da gripe pode exigir outras condições BSL maior e, portanto, condições especiais / medidas de segurança terão de ser seguidas. Tecido meios de cultura e soluções DMEM 10% FBS PS 1%: 445 ml meio modificado Dulbecco Águia (DMEM), 50 ml de soro fetal bovino (FBS), e 5 ml de 100X Penicilina / Estreptomicina (PS). Armazenar a 4 ° C. Essa mídia será usada para manter as células MDCK e 293T, bem como para a transfections. DMEM BA 0,3% a 1% PS: 495,7 ml de DMEM, 4,3 ml de 35% de albumina bovina (BA). Armazenar a 4 ° C. Pouco antes de usar, adicione TPCK tripsina tratada para uma concentração final de 1 mg / ml. Media infecciosas. Fosfato 10X solução salina tamponada (PBS): 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g de KH 2 PO 4. Adicionar DDH 2 O até 1 litro. Ajustar o pH para 7,3. Esterilizar em autoclave. Conservar à temperatura ambiente. 1X PBS: Diluir 1:10 com PBS 10X DDH 2 O. Esterilizar em autoclave e armazenar em temperatura ambiente.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Esforços por um número de grupos de pesquisa da gripe têm sido fundamental no desenvolvimento e melhoria da influenza A genética reversa do vírus. Originalmente estabelecida em 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; Plasmídeo baseado em técnicas de genética reversa para gerar vírus recombinante revolucionaram o campo de pesquisa da gripe, porque determinadas questões foram respondidas por engenharia genética, infecciosa, vírus da influenza recombinante. Esses estudos incluem a replicação do vírus, a função de proteínas virais, a contribuição de mutações específicas em proteínas virais na replicação viral e / ou patogênese e, também, vetores virais usando vírus influenza recombinantes expressando proteínas estranhas<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Resgate de vírus influenza A partir de DNA plasmídeo é uma técnica básica e essencial experimental que permite aos pesquisadores a gripe para gerar vírus recombinante para estudar os múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe, e para ser usado como vetores potenciais ou vacinas.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Imunologia e Infecção

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Resgate de Vírus da Doença de Newcastle recombinante de cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes para Influenza A detecção de vírus e Isolamento de suínos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...