Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить прошлых и настоящих членов в Адольфо Гарсия-Састре и Питер Палезе лаборатории для развития гриппа обратном методов генетики и плазмиды. Исследования в AG-S лабораторий частично финансируется CRIP, NIAID финансируемых центром передового опыта по изучению гриппа и надзора (HHSN266200700010C) и NIAD гранты R01AI046954, U01AI070469 и P01AI058113. Исследования в LM-S лаборатории частично финансируется NIAID грант RO1AI077719.

1. Вирус гриппа спасательных трансфекции Грипп вирус принадлежит к семейству Orthomyxoviridae отрицательных РНК вирусов с оболочкой. Гриппа, геном вируса состоит из восьми различных генов РНК отрицательной полярности, которые кодируют, по крайней мере, 11 вирусных белков (ри...

<ol>
	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Спасательная рекомбинантных вирусов гриппа из плазмиды ДНК представляет собой простой и понятный процесс когда-то протокол регулярно проводится в лаборатории, но в начале, несколько вещей может пойти не так. Крайне важно иметь хорошую подготовку плазмиды для создания вируса. Правиль?...

Клеточные линии 293T (каталожный номер CRL-11268) и MDCK (номер по каталогу CCL-34) клеточных линий ведутся в 37 ° C инкубаторе с 5% СО 2 в DMEM 10% FBS, 1% PS. Клетки доступной форме Американской коллекции типовых культур (АТСС, 10801 Университетского бульвара, Манассас, штат Вирджиния. 20110-2209 США). Эмбрионов куриных яиц Эмбрионах 10-дневных куриных яиц могут быть получены из Charles River Laboratories, конкретные Возбудитель птичьего питания взнос (SPAFAS) Птичий продуктов и услуг. Франклин Коммонс, 106 Рут 32, Северная Франклин, CT 06254 США. Яйца инкубируют при 37 ° С предыдущей и после вирусной инфекции. До и после вирусной инфекции, яйца candled для определения жизнеспособности эмбрионов. Это очень важно, чтобы искать мертвых икринок до и после вирусной инфекции. Перед инфекции мертвые яйца могут быть легко замечены отсутствие кровеносных сосудов, а также отсутствие эмбриона мобильности. Когда candled, живые эмбрионы двигаться. После вирусной инфекции мертвым яйцо (вероятно, связано с инфекцией гриппа вируса) будет легко узнать по плохим появление яйца с точки зрения малых и кровавые объема аллантоисной жидкости. Зараженные-яйца, отбрасываются в двойных мешках и автоклавируемый автоклавного следующие стандартные процедуры. Куриные красных кровяных телец (эритроцитов) Куриные РБК могут быть приобретены у Фермы Truslow, 201-Валли-роуд, Chestertown, Md 21620. Хранить при температуре 4 ° С. Для HA анализов, стирка 5 мл куриного РБК с 45 мл PBS 1X в 50 мл центрифужную пробирку. Центрифуга в течение 5 минут при 1000 оборотах, РТ. Отменить тщательно супернатант и использовать 1:1000 разбавления гранулированный РБК в PBS 1X (конечной концентрации 0,5-1,0% РБК). Культуры ткани супернатанты и аллантоисную жидкости Оба, культуры тканей супернатанты и аллантоисную жидкости можно хранить при температуре 4 ° С в течение короткого периода времени. После подтверждения вируса спасения, вирусов от клетки супернатанты или аллантоисной жидкости хранятся при температуре -80 ° C. Плазмиды Все плазмиды подготовлен с использованием рекомендаций плазмиды макси комплект следующих производителей. Все плазмиды аликвоту в концентрации 1 мкг / мл в DDH 2 O и хранится при температуре -20 ° C. Для кратковременного хранения, плазмиды можно хранить при температуре 4 ° C. Концентрация очищенной ДНК плазмиды определяется спектрофотометрически при 260 нм, с чистотой быть оценены с использованием 260:280 нм отношение. Препараты с 1,8-2,0 нм 260:280 отношения рассматриваются, выделяемых на цели вирус спасения. Кроме того, плазмиды концентрации и чистоты должен быть подтвержден в агарозном гель-хроматографии. Ambisense PDZ плазмиды (6), содержащий восемь гриппа A/PR/8/34 вирусных генов (7) показаны на рисунке 2. Вирусы Описанные протокол для спасения гриппа A/PR/8/34 может быть выполнена под уровня биобезопасности (BSL) 2 условий. Загрязненный материал, в том числе культуре ткани супернатанты и куриных эмбрионов, следует стерилизовать перед утилизацией. Спасение другой вирус гриппа, могут потребоваться более высокие BSL условиях и, следовательно, особые условия / безопасность измерений должны быть соблюдены. Ткани питательных сред и растворов DMEM 10% FBS 1% PS: 445 мл среды Дульбекко изменение Орла (DMEM), 50 мл фетальной телячьей сыворотки (FBS), и 5 мл 100X пенициллина / стрептомицина (PS). Хранить при температуре 4 ° С. Этот носитель будет использоваться для поддержания 293T и MDCK клеток, а также для трансфекции. DMEM 0,3% BA 1% PS: 495,7 мл DMEM, 4,3 мл 35% бычьего альбумина (BA). Хранить при температуре 4 ° С. Просто перед употреблением, добавить TPCK лечение трипсина в конечной концентрации 1 мкг / мл. Инфекционные СМИ. 10 раз фосфатным буферным раствором (PBS): 80 г хлористого натрия, 2 г хлорида калия, 11,5 г Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 г KH 2 PO 4. Добавить DDH 2 O до 1 л. Отрегулируйте рН до 7,3. Стерилизовать автоклаве. Хранить при комнатной температуре. 1X PBS: развести в 10 раз PBS 1:10 с DDH 2 O. Стерилизовать в автоклаве и хранить при комнатной температуре.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Усилия число групп гриппа исследования сыграли ключевую роль в развитии и совершенствовании гриппа генетики вируса наоборот. Первоначально создана в 1999 году<sup&gt; 1,2</sup&gt; Плазмиды основе обратного генетических методов для создания рекомбинантных вирусов революцию в области гриппом исследований, поскольку конкретные вопросы был дан ответ по генной инженерии, инфекционных, рекомбинантных вирусов гриппа. Такие исследования включают репликацию вируса, функция вирусные белки, вклад конкретных мутаций в вирусных белков в репликации вируса и / или патогенеза и, кроме того, вирусных векторов с использованием рекомбинантных вирусов гриппа выражения чужеродных белков<sup&gt; 3</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Спасение вирусов гриппа А из плазмиды ДНК является одним из основных и существенных экспериментальная методика, которая позволяет исследователям гриппа для создания рекомбинантных вирусов изучить несколько аспектов биологии вирусов гриппа, а также для использования в качестве потенциальных векторов или вакцин.

Генерация рекомбинантного вируса гриппа от ДНК плазмиды

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinity очистки вируса гриппа рибонуклеопротеидных комплексов с хроматина инфицированных клеток

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Спасение рекомбинантный Ньюкасл вирусное заболевание из кДНК

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Выражение функциональных рекомбинантного гемагглютинина и нейраминидазы белков от вируса H7N9 Роман гриппа Используя выражение бакуловирусной системе

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Грипп Вирус Распространение в куриные эмбрионы

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Интраназального введения рекомбинантного гриппа вакцин в химерных мышей Модели для изучения слизистых оболочек

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Генерация рекомбинантного человеческого IgG моноклональных антител из иммортализованных клеток Сортировка В

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Носовые салфетки для гриппа обнаружения вируса и изоляции от свиного

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro разборке вируса гриппа капсиды по градиентное центрифугирование

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Спасение и характеристика рекомбинантного вируса из нового мира Инфекционный клон вируса Зика

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...