Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
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Los autores desean agradecer a los miembros pasados ​​y presentes en la Adolfo García-Sastre y los laboratorios de Peter Palese para el desarrollo de la influenza técnicas de genética inversa y los plásmidos. La investigación en los laboratorios de AG-S está parcialmente financiado por CRIP, un centro financiado por el NIAID de Excelencia para la Investigación y Vigilancia de Influenza (HHSN266200700010C) y por las subvenciones NIAD R01AI046954, U01AI070469 y P01AI058113. La investigación en LM-S laboratorio está financiado parcialmente por el NIAID subvención RO1AI077719.

1. Virus de la gripe de rescate de la transfección Influenza A virus pertenece a la familia Orthomyxoviridae de cadena negativa virus ARN envuelto. La gripe A genoma del virus consiste en ocho diferentes genes de ARN de polaridad negativa que codifican, al menos, 11 proteínas virales (Figura 1) 4. Nos centraremos, en este informe, en el rescate de uno de la cepa de laboratorio más común, la gripe A/PR/8/34, 5 por medio de plásmidos ambisense (PDZ), que conti...

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Rescate de los virus de la influenza recombinante de ADN plásmido es un proceso simple y sencillo una vez que el protocolo se realiza rutinariamente en el laboratorio, pero en un principio, varias cosas pueden salir mal. Es imprescindible tener una buena preparación de plásmidos para generar el virus. El mantenimiento adecuado de las líneas celulares (293T y MDCK) es crucial para el éxito de un rescate viral. Tradicionalmente, un marcador genético se inserta en un gen que codifica la gripe plásmido, mediante muta...

Las líneas celulares 293T (número de catálogo CRL-11268) y MDCK (número de catálogo CCL-34) líneas de células se mantienen en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 en DMEM 10% FBS, 1% de PS. Las células se forman a disposición de la American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 EE.UU.). Huevos embrionados de pollo Embrionados de 10 días de edad, los huevos de gallina se puede obtener de los Laboratorios Charles River, específico de abastecimiento patógeno aviar Fee (SPAFAS) Productos y Servicios aviar. Franklin Commons, 106 Ruta 32, North Franklin, CT 06254 EE.UU.. Los huevos se incuban a 37 ° C antes y después de la infección viral. Antes y después de la infección viral, los huevos son trasluz para determinar la viabilidad de los embriones. Es muy importante para buscar los huevos muertos, antes y después de la infección viral. Antes de la infección de un huevo muerto puede ser fácilmente identificables por la ausencia de vasos sanguíneos, así como la falta de movilidad del embrión. Al trasluz, los embriones vivos se mueven. Después de la infección viral de un huevo muerto (probablemente relacionada con la infección por virus de la gripe) se puede divisar por el mal aspecto de los huevos como se ve por el menor volumen y sangrienta de fluido alantoideo. Infectados con huevos son descartadas en doble bolsa de autoclave y autoclave siguiendo los procedimientos estándar. Células de pollo de glóbulos rojos (RBC) RBC de pollo se pueden comprar en las granjas Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, MD 21620. Almacenar a 4 ° C. Para los ensayos de HA, lavado de 5 ml de RBC de pollo con 45 ml de PBS 1X en un tubo de centrífuga de 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm, RT. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y el uso de una dilución 1:1000 de los pellets de glóbulos rojos en PBS 1X (concentración final de 0.5 a 1.0% de glóbulos rojos). Sobrenadantes de cultivo de tejidos y fluidos alantoideo Tanto, los sobrenadantes de cultivo de tejidos y fluidos alantoideo se puede almacenar a 4 ° C por un período corto de tiempo. Después de confirmar rescate de virus, los virus de sobrenadantes de las células o el líquido alantoideo se almacenan a -80 ° C. Plásmidos Todos los plásmidos se preparan con las recomendaciones de un kit de plásmido maxi fabricante siguiente. Todos los plásmidos son alícuota en concentraciones de 1 mg / ml en ddH2O y almacenadas a -20 ° C. Para almacenamiento a corto plazo, el plásmido se puede mantener a 4 ° C. La concentración del ADN plásmido purificado se determina por espectrofotometría a 260 nm, con la pureza que se calcula utilizando la relación de 260:280 nm. Preparaciones a 1,8-2,0 260:280 nm ratios se consideran apropiados para fines de salvamento virus. Además, la concentración de plásmido y la pureza debe ser confirmada con la cromatografía en gel de agarosa. Ambisense PDZ plásmidos (6) que contiene los ocho genes virales de la gripe A/PR/8/34 (7) se ilustra en la Figura 2. Virus El protocolo descrito para el rescate de la gripe A/PR/8/34 se puede realizar bajo nivel de bioseguridad (BSL) 2 condiciones. Material contaminado, incluyendo los sobrenadantes de cultivo de tejidos y los huevos embrionados, deben ser esterilizados antes de su eliminación. Rescate de otros virus de la influenza puede requerir mayores condiciones BSL y, por tanto, las condiciones especiales / medidas de seguridad tendrá que ser seguido. Medios de cultivo y soluciones DMEM 10% de SFB 1% PS: 445 ml de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), 50 ml de suero fetal bovino (FBS), y 5 ml de 100X penicilina / estreptomicina (PS). Almacenar a 4 ° C. Este medio se utiliza para mantener las células 293T y MDCK, así como para las transfecciones. DMEM 0,3% BA 1% PS: 495,7 ml de DMEM, 4,3 ml de 35% de albúmina bovina (BA). Almacenar a 4 ° C. Justo antes de su uso, agregar la tripsina TPCK tratada a una concentración final de 1 mg / ml. Los medios de comunicación infecciosas. Fosfato de 10 veces (PBS): 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g de KH 2 PO 4. Añadir ddH2O hasta 1 litro. Ajustar el pH a 7.3. Esterilizar en autoclave. Conservar a temperatura ambiente. 1X PBS: Diluir 10 veces con PBS 1:10 ddH 2 O. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Los esfuerzos realizados por varios grupos de investigación de la gripe han sido fundamentales en el desarrollo y la mejora genética de la influenza A virus inversa. Originalmente establecida en 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; Plásmido basado en técnicas de genética inversa para generar virus recombinantes han revolucionado el campo de la investigación de la gripe debido a cuestiones específicas han sido contestadas por la ingeniería genética, los virus infecciosos de la gripe recombinante. Estos estudios incluyen la replicación del virus, la función de las proteínas virales, la contribución de las mutaciones específicas en las proteínas virales en la replicación viral y / o patogénesis y, también, los vectores virales con virus recombinantes que expresan proteínas extrañas influenza<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Rescate de virus de gripe A a partir del ADN plásmido es una técnica experimental básica y esencial que permite a los investigadores de la gripe para generar virus recombinantes para estudiar múltiples aspectos de la biología de los virus de la influenza, y para ser utilizado como vectores potenciales o vacunas.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Toallitas para Influenza A Detección de Virus y aislamiento de los cerdos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro El desmontaje de virus de influenza A cápsides por centrifugación en gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...