Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Författarna vill tacka tidigare och nuvarande medlemmar i Adolfo García-Sastre och Peter Palese laboratorier för utveckling av influensa omvänd genetik tekniker och plasmider. Forskning i AG-S laboratorier är delvis finansierat av Crip, en NIAID-finansierade Center of Excellence för influensa forskning och övervakning (HHSN266200700010C) och NIAD bidrag R01AI046954, U01AI070469 och P01AI058113. Forskning i LM-laboratorium är delvis finansierat av NIAID bidrag RO1AI077719.

1. Influensavirus rädda transfektion Influensa A-virus tillhör Orthomyxoviridae familj negativa RNA höljeförsedda virus. Det influensa A-virus arvsmassa består av åtta olika RNA-gener av negativ polaritet som kodar åtminstone 11 virala proteiner (Figur 1) 4. Vi kommer att fokusera, i denna rapport, om att rädda en av de vanligaste laboratoriet stam, A/PR/8/34 influensa, 5 med ambisense plasmider (PDZ) som innehåller 8 influensa A/PR/8/34 virus segment ( ...

<ol>
	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Räddning av rekombinant influensavirus från plasmid-DNA är en enkel och okomplicerad process när protokollet rutinmässigt utförs i laboratoriet, men i början kan flera saker går fel. Det är viktigt att ha bra plasmid förberedelser för att skapa viruset. Korrekt underhåll av cellinjer (293T och MDCK) är avgörande för en framgångsrik viral räddning. Traditionellt är en genetisk tagg in i en influensa gen-kodning plasmid genom tysta mutagenes. Införandet av denna tysta mutation (er) och inrättandet av, ...

Cellinjer 293T (katalognummer CRL-11.268) och MDCK (katalognummer CCL-34) är cellinjer hållas i 37 ° C inkubator med 5% CO 2 i DMEM 10% FBS, 1% PS. Celler finns bilda American Type Culture Collection (ATCC, 10.801 University Boulevard, Manassas, VA. 20.110-2209 USA). Embryonerade hönsägg Embryonerade 10-dagsgamla kycklingar ägg kan erhållas från Charles River Laboratories, aktuella patogenen Avgift Aviär Supply (SPAFAS) Aviär Produkter och Tjänster. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06.254 USA. Ägg inkuberas vid 37 ° C före och efter virusinfektion. Före och efter virusinfektion, är äggen genomlysas för att bestämma lönsamheten av embryon. Det är mycket viktigt att leta efter döda ägg före och efter virusinfektion. Innan infektion en död ägg kan lätt upptäckas genom avsaknad av blodkärl samt avsaknaden av embryot rörlighet. När genomlysas, levande embryon flytta. Efter virusinfektion en död ägg (troligen relaterade till influensa-virus infektion) kommer att vara lätt upptäckas av dåliga utseende ägget som ses av de mindre och blodiga volym allantoisvätska. Infekterade-ägg som kastas i dubbel autoklaverbara påsar och autoklaveras efter standardförfaranden. Kyckling röda blodkroppar (RBC) Kyckling RBC kan köpas från Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21.620. Förvaras vid 4 ° C. För HA-analyser, tvätta 5 ml av kyckling RBC med 45 ml PBS 1X i ett 50 ml centrifugrör. Centrifugera i 5 minuter vid 1000 varvtal, RT. Kasta försiktigt supernatanten och använda en 1:1000 spädning av pelleterat RBC i PBS 1X (slutlig koncentration av 0,5 till 1,0% RBC). Vävnadskultur supernatanterna och allantoisvätska Båda, vävnadskultur supernatanterna och allantoisvätska kan lagras vid 4 ° C under en kort tid. När du har bekräftat virus räddning, är virus från cell supernatanterna eller allantoisvätska förvaras vid -80 ° C. Plasmider Alla plasmider är beredda att använda en plasmid Maxi kit efter tillverkarens rekommendationer. Alla plasmider delprov vid koncentrationer på 1 mikrogram / ​​ml i DDH 2 O och förvaras vid -20 ° C. För kortvarig förvaring, kan plasmid kan hålla vid 4 ° C. Koncentrationen av det renade DNA-plasmid bestäms med spektrofotometri vid 260 nm, med renhet som uppskattas med hjälp av 260:280 nm förhållandet. Preparat med 1,8-2,0 260:280 nm nyckeltal anses disponeras för ändamål virus räddning. Dessutom bör plasmid koncentration och renhet bekräftas med agarosgel kromatografi. Ambisense PDZ plasmider (6) som innehåller åtta influensa A/PR/8/34 virala gener (7) illustreras i figur 2. Virus Den beskrivna protokoll för att rädda influensa A/PR/8/34 kan utföras under biosäkerhetsnivå (BSL) 2 förhållanden. Förorenat material, inklusive supernatanter vävnadsodling och embryonerade ägg, bör steriliseras före kassering. Räddning av andra influensavirus kan kräva högre BSL villkor och därför särskilda villkor / säkerhet mätningar kommer att behöva följas. Vävnadskultur medier och lösningar DMEM 10% FBS 1% PS: 445 ml Dulbecco ändrade Eagles medium (DMEM), 50 ml Fetalt bovint serum (FBS), och 5 ml 100X Penicillin / streptomycin (PS). Förvaras vid 4 ° C. Detta kommer att användas för att upprätthålla 293T och MDCK celler samt för transfections. DMEM 0,3% BA 1% PS: 495,7 ml DMEM, 4,3 ml av 35% bovint albumin (BA). Förvaras vid 4 ° C. Strax före användning, lägg TPCK behandlas trypsin till en slutlig koncentration av 1 mikrogram / ml. Smittsamma medier. 10X Fosfatbuffrad saltlösning (PBS): 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na 2 HPO 4 0,7 H 2 O, 2 g KH 2 PO 4. Lägg DDH 2 O upp till 1 liter. Justera pH till 7,3. Sterilisera genom autoklavering. Förvara i rumstemperatur. 1X PBS: Späd 10X PBS 1:10 med DDH 2 O. Sterilisera autoklav och förvara i rumstemperatur.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Insatser från ett antal influensa forskargrupper har varit avgörande för utveckling och förbättring av influensa A-virus genetik bakåt. Ursprungligen bildades 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; Plasmid-baserad omvänd genetisk teknik för att generera rekombinanta virus har revolutionerat den influensa forskning eftersom specifika frågor har besvarats av genetiskt modifierade, infektionssjukdomar, rekombinant influensavirus. Sådana studier inkluderar virusreplikation, funktion av virala proteiner, bidrag från särskilda mutationer i virala proteiner i virusreplikation och / eller patogenes och, också, virala vektorer med hjälp av rekombinant influensavirus uttrycka främmande proteiner<sup&gt; 3</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Rescue av influensa A-virus från plasmid-DNA är en grundläggande och viktig experimentell teknik som gör att influensa forskare att generera rekombinant virus för att studera flera aspekter i biologi influensavirus, och användas som potentiella vektorer eller vacciner.

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrening av ribonukleoprotein influensavirus komplex från kromatinet hos infekterade celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Räddning av rekombinant Newcastlevirus från cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Uttryck av Functional rekombinant hemagglutinin och neuraminidas Proteiner från Novel H7N9 influensavirus Använda baculovirusexpressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influensa viruspropagering i embryonerade hönsägg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration av rekombinant influensavacciner i chimär musmodeller för att studera slemhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Framställning av rekombinant human IgG monoklonala antikroppar från Immortaliserade Sorterat B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes för influensa A-virus Upptäckt och isolering från svin

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

I vitro Demontering av influensa A-virus-kapsider genom gradientcentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Räddning och karaktärisering av rekombinant virus från en ny världsinfektiös klon från Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...