Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Yazarlar grip ters genetik teknikler ve plazmid gelişimi için Adolfo Garcia Sastre ve Peter Palese laboratuvarlar geçmişteki ve şimdiki üyelerine teşekkür etmek istiyorum. AG-S laboratuarlar Araştırma Crip, Grip Araştırma ve Gözetim Mükemmellik NIAID tarafından finanse edilen Merkezi (HHSN266200700010C) ve NIAD hibe R01AI046954, U01AI070469 ve P01AI058113 tarafından kısmen finanse edilmektedir. LM-S laboratuvar Araştırma kısmen NIAID hibe RO1AI077719 tarafından finanse edilmektedir.

1. İnfluenza virüs kurtarma transfeksiyon İnfluenza A virüsü negatif iplikli RNA zarflı virüs Orthomyxoviridae ailesine aittir. Influenza A virüs genomunun en az 11 viral proteinler (Şekil 1) 4, kodlamak negatif polarite sekiz farklı RNA genleri oluşur. (8 grip A/PR/8/34 viral segmentleri içeren ambisense plazmid (pDZ) kullanarak en sık rastlanan laboratuvar suşu, grip A/PR/8/34, 5 kurtarma, bu raporda, durulacak Şekil 2). <p class="jove_conten...

<ol>
	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Plazmid DNA rekombinant influenza virüslerinin Kurtarma sonra protokol rutin laboratuarda gerçekleştirilen basit ve kolay bir süreç, ama başında, birden fazla şeyler ters gidebilir. Virüs oluşturmak için iyi bir plazmid hazırlanması zorunludur. (293T ve MDCK) hücre hatları doğru bakım başarılı bir viral kurtarılması için çok önemlidir. Geleneksel olarak, genetik bir etiket sessiz mutagenez, bir grip plazmid gen kodlama içine eklenir. Bu sessiz mutasyon (lar) ve örneğin, yaratılış giriş, b...

Hücre dizileri 293T (katalog numarası CRL-11268) ve MDCK (katalog numarası CCL-34) hücre hatları DMEM% 10 FBS,% 1 PS% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör tutulur. Hücreler American Type Culture Collection (ATCC 10801 Üniversitesi Bulvarı, Manassas, VA 20.110-2209 ABD) bulunan bir biçimidir. Embriyolu tavuk yumurtası Charles River Laboratuvarları, Özel Patojen Ücreti Kuş Kaynağı (SPAFAS) Kuş Ürünler ve Hizmetler embriyolu 10 günlük civciv yumurta elde edilebilir. Franklin Commons, 106 Route 32, Kuzey Franklin, CT 06.254 ABD. Yumurtalar 37 ° C önceki ve viral enfeksiyondan sonra inkübe edilir. Viral enfeksiyon önce ve sonra, yumurta, embriyo canlılığını belirlemek için candled vardır. Bu viral enfeksiyon öncesi ve sonrasında ölü yumurta bakmak için çok önemlidir. Önce ölü bir yumurta bulaşmış kan damarlarının olmaması yanı sıra embriyo hareketlilik olmaması tespit edilebilir. Candled, canlı embriyolarının hareket eder. Viral enfeksiyondan sonra ölü bir yumurta (muhtemelen influenza virüs enfeksiyonu ile ilgili) kolayca allantoik sıvı hacmi küçük ve kanlı görüldüğü gibi yumurtanın kötü görünüşü fark olacaktır. Etkilenmiş-yumurta çift otoklav torbaları atılır ve standart prosedürler takip otoklavlanırlar. Tavuk kırmızı kan hücreleri (eritrosit) Tavuk RBC Truslow Çiftlikleri, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620 satın alınabilir. 4 ° C saklayınız HA deneyleri için tavuk RBC 5 ml, 45 ml, 50 ml santrifüj tüpüne PBS 1X yıkayın. 1000 rpms, RT az 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatle atın ve PBS 1X pelet RBC 1:1000 dilüsyon (0.5-1.0% RBC final konsantrasyon) kullanabilirsiniz. Doku kültürü süpernatantlar ve allantoik sıvıları , Doku kültürü süpernatantlar ve allantoik sıvıları, 4 ° C, kısa bir süre için saklanabilir. Virüs kurtarma onayladıktan sonra, hücre süpernatantlar virüs veya allantoik sıvı -80 ° C&#39;de saklanır. Plazmidler Plazmid plazmid maxi kiti aşağıdaki üretici öneriler kullanılarak hazırlanmıştır. Tüm plazmid GKD 2 O 1 mcg / ml konsantrasyonlarda kısım ve -20 ° C&#39;de saklanan Kısa süreli depolama için, 4 tutmak plazmid olabilir ° C Plazmid saflaştırılmış DNA konsantrasyonu, saflığı 260:280 nm oranı kullanılarak tahmin, 260 nm&#39;de spektrofotometre tarafından belirlenir. 1,8-2,0 260:280 nm oranları ile hazırlıklar virüs kurtarma amaçlı tahsis kabul edilir. Ayrıca, plazmid konsantrasyonu ve saflık agaroz jel kromatografisi ile teyit edilmelidir. Ambisense pDZ plazmid (6), sekiz grip A/PR/8/34 viral genler (7) içeren Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Virüsler Grip A/PR/8/34 kurtarmak için açıklanan protokol biyogüvenlik düzeyi (BSL) 2 koşulları altında yapılabilir. Doku kültürü süpernatantlar ve embriyolu yumurta da dahil olmak üzere kontamine malzeme, atmadan önce sterilize edilmelidir. Diğer grip virüsü Kurtarma yüksek BSL koşulları ve bu nedenle, özel koşullar / güvenlik ölçümleri takip gerekecektir gerekebilir. Doku kültürü medya ve çözümler DMEM% 10 FBS% 1 PS: 445 ml Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta (DMEM), fetal sığır serumu (FBS) 50 ml ve 5 ml 100X Penisilin / Streptomisin (PS). 4 ° C saklayınız Bu ortam transfections 293T ve MDCK hücreleri gibi korumak için kullanılır. DMEM% 0.3 BA% 1 Not: DMEM 495,7 ml, 4.3 ml% 35 Bovine Albumin (BA). 4 ° C saklayınız Kullanmadan önce, son bir 1 mg / ml konsantrasyonu TPCK tedavi tripsin ekleyin. Enfeksiyon medya. 80 g NaCl, 2 g KCl, Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g KH 2 PO 4 11,5 g: 10X fosfat tamponlu salin (PBS). 1 litre kadar GKD 2 O ekleyin. PH 7.3 &#39;e ayarlayın. Otoklav ile sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın. 1X PBS: GKD 2 O. ile seyreltin 10X PBS 01:10 Oda sıcaklığında ve mağaza otoklav ile sterilize edin.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Grip araştırma grupları bir takım çabalar, influenza A virüsünün ters genetik geliştirme ve iyileştirme kilit edilmiştir. 1999 yılında kurulmuş.<sup&gt; 1,2</supSpesifik sorular, genetik mühendisliği, enfeksiyon, rekombinant influenza virüsleri ile cevap çünkü rekombinant virüsler üretmek için plazmid tabanlı ters genetik teknikleri influenza araştırma alanında devrim yarattı. Bu tür çalışmalar, virüs replikasyonu, virüs proteinleri işlevi, viral replikasyon ve / veya patogenezinde viral proteinlerin belirli mutasyonlar katkısı ve ayrıca, viral vektörlerin, yabancı proteinler ifade rekombinant influenza virüslerinin kullanarak<sup&gt; 3</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Plazmid DNA influenza A virüsleri Kurtarma grip araştırmacılar grip virüsünün biyoloji çeşitli yönlerini incelemek amacıyla rekombinant virüsler üretmek için, ve potansiyel vektörler veya aşı olarak kullanılmak üzere izin veren bir temel ve temel deneysel bir tekniktir.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...