Name: a thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation
Uploaded: 2010-09-19T17:00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation at JoVE.com

نشكر اميلي ألف كيلي رئيس لتصميم لوحة. نحن ممتنون للدعم من المعاهد الوطنية للصحة لجوائز HAG : PO1 MH64570 ، RO1 MH56838 ، RO1 MH078989 ، R21 MH03851 والدعم السخي للصندوق Waasdorp جيفري الأعصاب للأطفال والتي بدونها لن هذا العمل لم يكن ممكنا. وتمول من قبل المعاهد الوطنية للصحة بأنقرة (EY019277) ، ومؤسسة وايتهول ، وP. ألفريد سلون ومؤسسة جائزة شهادة في العلوم الطبية الحيوية من صندوق ويلكوم بوروز. وتمول من قبل MET دي فون LA RECHERCHE EN دو كيبيك سانتي (FRSQ) ما بعد الدكتوراه جائزة التدريب. سوق دبي المالي هو متدرب في برنامج التدريب الطبي العلماء ، بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة T32 GM07356 وAI049815 T32.

1. إعداد الحيوانية للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تجاربنا ، ونحن نستخدم الكبار 3 CX CR الفئران GFP 1 / + التي يمكن استخدامها في التعبير عن GFP الأنساب الخلايا وحيدة النواة ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة. 4 سلالات مختلفة من الفئران لتلبية احتياجات مشروع معين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من مزيج يتألف من المخدرات three الفنتانيل ملغم / كغم 0.05 ، 5.0 ملغم / كغم الميدازولام ، و 0.5 Medetomidine ملغم / كغم. 5 التحضير الجراحي ليبدأ بعد TSCW الحيوان لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة ، مثل كما قرصة الذيل. طوال الجراحة والتصوير ، وعلينا أن نحافظ على الحيوان على وسادة تدفئة لمنع ما بعد التخدير انخفاض حرارة الجسم. إذا لزم الأمر ، يمكن لجرعة منشطة من ثلث إعطاء الجرعة الأصلي للكوكتيل مخدر لاستعادة الطائرة مخدر الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية أعين الحيوان مع مرهم للعين وقائية للحفاظ على العينين رطبة أثناء التخدير ، الذي يكبت المنعكس الحيوان الوميض. إزالة الشعر من فروة الرأس للحيوان باستخدام شفرة حلاقة ، ومقصات ، ومقص ، أو أساليب كيميائية. تطهير فروة الرأس باستخدام 10 ٪ محلول البوفيدون اليودي والايثانول 70 ٪. جميع الأدوات الجراحية يلزم تعقيمها ، معقم للتعقيم الزجاج حبة ، أو تطهيرها مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق خط الوسط من فروة الرأس باستخدام مقص صغير ، بدءا 4-5 ملم الذيلية في الجمجمة والمضي قدما إلى الأمام إلى الأمام من وجهة نظر. المهم أن هذا الشق طويلة بما فيه الكفاية أن الجلد لن تتدخل مع لصق لوحة الرأس التي تستخدم لتحقيق الاستقرار في رأس الفأر خلال جلستين الفوتون التصوير (الشكل 1). تحديد المنطقة لتكون ضعيفة تحت نطاق تشريح. تجنب المناطق ذات الاهتمام تقع مباشرة عبر خيوط الجمجمة ، والجمجمة وأقل استقرارا في هذه المناطق والأسباب الكامنة السفن الكبيرة والسحايا وسوف تتداخل مع التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الإيثانول بنسبة 100 ٪ تليها حل 10 ٪ من كلوريد الحديديك مع مسحة القطن المعقم لتجف الأغشية على قمة الجمجمة وتتخلص منهم بعيدا باستخدام الملقط الغرامة أو شفرة حلاقة. فشل لإزالة النتائج غير المستقرة في الأغشية رئيس مرفق لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبقة رقيقة من الغراء 910 Permabond حول حواف الإطار عرض لوحة تحت الرأس. مكان لوحة مغطاة الرأس الغراء فوق منطقة الفائدة على جمجمة الحيوان مع الضغط الخفيف (الشكل 1). من المهم أن يتم لصقها فقط لوحة التوجه الى عظمة الجمجمة. فإن أي الجلد أو الأغشية التي اشتعلت بين لوحة جمجمة الرأس وانخفاض في استقرار السندات. تنطبق على كمية صغيرة من اكريليت حول نافذة عرض لاستخدام حقنة الفور السندات الغراء. أخيرا ، وتطبيق كمية صغيرة من وكتايت 454 إلى حواف الإطار عرض لمنع التسريبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المسمار لوحة رئيس لصاحب الحيوان (الشكل 1) وتحقق الاستقرار في لوحة الرأس تحت نطاق تشريح التي تحقق باستخفاف مع زوج من الملقط. يجب أن يكون هناك أي تحرك من الجمجمة النسبي إلى لوحة الرأس. وضع قطرة من المياه المالحة على نافذة عرض لضمان عدم وجود تسربات. </li></ol> 2. إعداد إطار الجمجمة ضعيفة القشرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعدادا لترقق الجمجمة وجافة الجمجمة باستخدام مزيج من مسحات القطن المعقم والهواء المضغوط. نحن في البداية رقيقة الجمجمة مع قليلا IRF العقيمة حفر حفر 007 في الثاني Microtorque مجموعة في 4000 دورة في الدقيقة. بلطف جدا ، تبدأ رقيق قطره ملم 2-2،5 منطقة دائرية من الجمجمة. استخدام الاقتراحات التي تجتاح الضوء الوحيد موازية تقريبا لالجمجمة ، واستخدام أي ضغوط مباشرة الهبوطي. وقف عمليات الحفر في كل ثانية 20-30 لإزالة الغبار العظام باستخدام الهواء المضغوط. هذه القطع في حفر تسمح للجمجمة لتبريد حتى لا يكون هناك أي ضرر الناجم عن الحرارة للأنسجة الدماغ الكامنة. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما تقدم الحفر ، لاحظ التحول إلى طبقة العظم الإسفنجي رطوبة (أي &quot;diploe&quot;). حالما يتم التوصل إلى هذه الطبقة ، وممارسة الحذر اضافية مع الحفر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختيار أحيانا ركاكة من الجمجمة عن طريق وضع المالحة فوق منطقة ضعيفة وعرض ضمن نطاق تشريح. وسوف تتيح زيادة الملوحة تبديد الحرارة. كما ضعفت الجمجمة ، أصغر الأوعية الدموية تصبح مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأسنان microblade العقيمة لتحقيق النهائية رقيق تحت المالحة ، كما يوفر التغذية الراجعة microblade اللمس أكثر نحو الاستقرار في الجمجمة. وهذا يسمح للأرق بكثير من التحضيرات مع الحفر وحدها. من تجربتنا ، وسماكة الجمجمة الأمثل هو 10-30 ميكرومتر. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن المهم للتحقق من ركاكة من الجمجمة تحت عدة مرات خلال epifluorescence المحاولات القليلة الأولى في صنع نافذة الجمجمة رقيقة. من حدة وعمق الخلايا الدبقية الصغيرة وضوحا والأوعية الدموية تعطي مؤشرا جيدا بالنسبة إلى عندما تكون النافذة جاهزة للتصوير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في إطار جاهز ، الغراء قطعة مستطيلة مصنوعة خصيصا لل# 0 ساترة واي<html> عشر بعدا من أقل من 2 ملم على كل جانب أكثر من النافذة. باستخدام ماصة 1.0 مم الزجاج ، ضع قطرة صغيرة من الغراء cyanoacrylate على منطقة الجمجمة ضعيفة وأقل بعناية أسفل قطعة صغيرة من ساترة ، ثم اضغط بلطف على الجمجمة إلى استنزاف كمية كبيرة من الصمغ. فمن المهم لتجنب تشكيل فقاعة بين الزجاج والغراء منذ الهواء المحبوس يؤدي إلى أن تصبح المنطقة تحت مبهمة بصريا. يتم استخدام الغراء cyanoacrylate لأنه لا يزال شفافا عندما تجف ، ويمنع كذلك إعادة نمو العظام والحفاظ على غشاء الجمجمة تحت النافذة رقيقة وشفافة. إذا كان هناك أي الغراء على أعلى من الزجاج غطاء ، استخدم microblade لإزالة بعناية لمرة واحدة لتغطية الزجاج في مكان والغراء جافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يدار على مسكن (على سبيل المثال ، البوبرينورفين 2 ملغم / كغم من الباطن cutaneously) فورا بعد الجراحة وإعادة تديرها في أي علامات الألم ، بما في ذلك عدم الرغبة في التحرك ، وتناول الطعام أو الشراب ، وفقدان الوزن ، واللعاب ، انتصاب الشعر ، والأصوات التنفسية ، إلخ </li></ol> 3. ثنائي الفوتون التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضيرا لمدة الفوتون التصوير ، مع تغطية TSCW المالحة وتحديد مجالات الاهتمام في إطار epifluorescence (الشكل 2). لتمكين التصوير اللاحقة في المنطقة ، التقاط صورة باستخدام كاميرا التصوير الفوتوغرافي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاثنين من الفوتون التصوير ، ونحن نستخدم عادة من صنع اثنين الفوتون المجهر مع تي 6 : ليزر الياقوت ضبطها ل920 نانومتر. تم الكشف عن مضان باستخدام أنبوب مضخم للضوء في وضع كشف كامل الحقل وتصفية الانبعاثات 580/180. ويتم استخدام مياه الغمر 20X عدسة (0.95 NA) طوال الدورة التصوير. يتم تعيين الحد الأقصى لانتاج الطاقة الليزر على الهدف بين 50 و 65 ميغاواط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مساحة من الاهتمام في طبقات قشرية الأول أو الثاني (تصل إلى 150 ميكرومتر تحت سطح حنوني). لتسهيل إعادة التصوير ، والتقاط صور لنفس الحقل نظر في 2X ، 1X ، وتقريب رقمي 3X. الأوعية الدموية يمكن أن تكون بمثابة معالم للعثور بسهولة على نفس الحقل للعرض خلال جلسات التصوير لاحقة. يمكن تحت التكبير ، متعددة Z - 3X مع مداخن 80-90 سيتم شراؤها Z - الخطوات في كل خطوة ومكدس 0.69 ميكرون كل 5 دقائق لمدة تصل إلى 30 دقيقة ، والتي تمكن عينة جيدة من التشكل دبقية صغيرة والسلوك على مر الزمن ( الشكل 3). بين الاستحواذ على Z - المداخن ، ينبغي للمرء أن تحقق مستوى الملوحة على TSCW ، فضلا عن عمق الحيوان للتخدير. </li></ol> 4. حقن عصبي HIV - 1 ، تات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، silanize البطانة الداخلية للإبرة قياس 35 و 10 حقنة Microvolume ميكرولتر لمنع ترسب تات. سحب الحل silanizing (Sigmacote) حتى يملأ كل من الإبر والمحاقن. يسمح الحل للجلوس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الحل فارغة من المحاقن ، وإزالة المكبس ، والسماح للالمحاقن والإبر حتى يجف تماما. أخيرا ، وغسل المحقنة والإبرة جيدا بالماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء حج القحف صغيرة قطرها 0.5 مم 3 مم إما منقاري أو الجانبية للTSCW حيث تم الحصول على صور ثنائية الفوتون ، باستخدام أصغر قليلا الحفر وترقق بعناية الجمجمة حتى زوج من ملقط مع نصائح حادة يمكن إزالة طبقة رقيقة من العظم بعيدا بسهولة. نحن نستخدم 10 المحاقن Microvolume ميكرولتر مزودة إبرة قياس 35 يسيطر عليها ضخ حقنة Ultramicropump الثالث شنت على micromanipulator من 3 محاور ، وبعد اصطفاف طرف الإبرة إلى حج القحف ، فمن المتقدمة بدقة على عمق 700-900 ميكرون أدناه السطح حيث حنوني 3 ميكرولتر تات 1-72 (أو غيرها من العوامل المؤيدة للالتهابات) أو المالحة (أو مراقبة المركبات) يتم تسليمها في 80 NL / دقيقة. </li></ol> 5. الحيوان الإسكان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان هذا الحيوان هو أن تكون التقط عدة مرات في يوم واحد ، تغطي مساحة مفتوحة من الجمجمة مع خليط من مرهم للعين والفازلين لمنع الإزعاج أو الأضرار التي لحقت في الجمجمة بين جلسات التصوير. قطع الجسر من دعم لوحة رأس الصغيرة (انظر الشكل 1B) ، ومكان للحيوان في قفص حرارة يمكن الوصول إليها بسهولة مع الطعام والماء. جميع الحيوانات ويتم توفير مساكن منفردة بعد عملية جراحية في جميع الأوقات. مرة واحدة في دورات التصوير للحيوان كاملة ليوم معين ، وإزالة بعناية كاملة وجها لوحة وخياطة الجلد إلى أكثر من الجمجمة مع # 6 أو أصغر خياطة. مرة أخرى ، البيت الحيوانات منفردة مع الغذاء والماء يمكن الوصول إليها بسهولة بين أيام التجريبية. التحقق من الحيوانات يوميا لأي علامات الاجهاد ، والألم ، أو العدوى. </li></ol> 6. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الحيوانية لتحقيق الاستقرار لعملية جراحية واثنين من الفوتون التصوير (A) ورئيس تصميم لوحة (B). <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. GFP المسمى تصور مع الخلايا الدبقية الصغيرة epifluorescence. jove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. GFP المسمى الخلايا الدبقية الصغيرة تصور مع اثنين من الفوتون التصوير بعد زرع TSCW ، ما يقرب من 50 ميكرومتر تحت سطح حنوني ، واحد ثنائي الفوتون المقاطع التي اتخذت 15-30 دقيقة بعد زرع TSCW (يوم 0) ، وكذلك 7 و 17 يوما في وقت لاحق ، على أن يبقى النوافذ واضح بينما تبقى الخلايا الدبقية الصغيرة المعطلة في غياب الشتائم للالتهابات. ض التوقعات التي اتخذت 6 و 24 ساعة بعد الحقن لفيروس نقص المناعة البشرية عصبي تغييرات مثيرة للإعجاب متبادلة المعرض المورفولوجي لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة شريط الحجم : 10 ميكرون.

<ol>
	<li>Mostany, R., &amp;amp, P. o. r. t. e. r. a. -. C. a. i. l. l. i. a. u., C, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. 12, (2008).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, (2009).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).</li><li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).</li><li>Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity.">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-96 (2007).</li><li>Majewska, A., Yiu, G., &amp;amp, Y. u. s. t. e., R, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system.">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).</li><li>Sharer, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+HIV-1+infection+of+the+central+nervous+system.">Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system.</a> A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).</li><li>Everall, I. P., Aliberti, J., &amp;amp, B. a. l. c. e. r. z. y. k., M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+density+in+the+superior+frontal+and+temporal+gyri+does+not+correlate+with+the+degree+of+human+immunodeficiency+virus-associated+dementia.">Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia.</a> Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).</li><li>Masliah, E., Banati, R. B., &amp;amp, Q. u. i. n. l. a. n., M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+injury+is+a+pathological+substrate+for+human+immunodeficiency+virus-related+cognitive+disorders.">Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders.</a> Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).</li><li>Everall, I. P., Banati, R. B., &amp;amp, U. p. e. n. d. e. r., B, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+synaptic+density+is+reduced+in+mild+to+moderate+human+immunodeficiency+virus+neurocognitive+disorder.">Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder.</a> Brain Pathol. 9, (1999).</li><li>Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &amp;amp, M. c. A. r. t. h. u. r., C, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+in+the+brain:+correlations+with+dementia.">Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia.</a> Ann Neurol. 38, (1995).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هناك اجماعا متزايدا على ان الركيزة الفعلية لHIV - 1 عجز عصبي المرتبطة بها (اليد) هو تدمير البنية متشابك ، المفترض أنها ناتجة عن التهابات وسطاء الموالية للصدر من HIV - 1 البالعات وحيدات النوى المصابة. تعتبر التنشيط دبقية صغيرة ، والخلايا العملاقة multinucleated ، ونظرا لتضخم دباق نجمي بصمات غير محدد من HIV - 1 العدوى والالتهابات في الجهاز العصبي المركزي 7. في المقابل ، ارتبط شدة المرض العصبي سابق للموت مع فقدان متشابك من التعقيد ، فضلا عن عبء البلاعم في الجهاز العصبي المركزي 8،9،10،11. ومع ذلك ، التفاعلات الدينامية بين الخلايا الدبقية الصغيرة ، الطرفية التسلل الضامة ، والخلايا العصبية لدى المرضى الذين يعانون HAND ببساطة لا يمكن أن تكون على غرار باستخدام المعالجة التقليدية الثابتة التي تم الحصول عليها من دراسات immunocytochemical التقليدية. وقد اقترحت الدراسات الحديثة من مختبراتنا التي يمكن أن تكون على غرار ما لا يقل عن بعض من هذه التفاعلات بين الخلايا وحيدة النواة المركزية والطرفية ، والخلايا العصبية في جزء منه عن طريق الحقن المجسم للبروتين HIV - 1 تات 1-72 في حمة الدماغ (لو ، ماركر ، تريمبلي ، تشي ، وGelbard ، بيانات غير منشورة). ولذلك قررنا أن تطبق في مجال التصوير فيفو الفوتون اثنين إلى دراسة التفاعل بين الوحيدات المستمدة الضامة ، الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ والخلايا العصبية المقيمين ، في نموذج حيوان صغير الانقياد لneuroAIDS. في حين أن الأعمال التحضيرية مفتوحة الجمجمة أو ضعفت الجمجمة وتحمل فحص واحد للعمارة القشرية لفترة وجيزة من الزمن (ساعة) ، والمحققين المهتمين دوام الأحداث تحت الحاد لا يمكن استخدام هذه المستحضرات دون تفعيل artifactually الخلايا الدبقية الصغيرة / بلعم بسبب التلاعب الجراحي نافذة قبي. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة بسيطة للتحايل هذه القيد بواسطة لصق قطعة صغيرة من الزجاج ساترة فوق منطقة الجمجمة ضعيفة منع من تجديد القبة في TSCW فضلا عن الحفاظ على شبه الشفافية لأسابيع 3 ≥. نظهر أيضا أن هذه التقنية تسمح لنا بمراقبة سلوك حيدات الطرفية دخول microvasculature الدماغي وكذلك الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ المقيم في الاستجابة لحقن المجسم من فيروس نقص المناعة البشرية 1-72 تات في القشرة من الفئران متخالف لCX CR 3 / 1 GFP ( لتحديد الخلايا وحيدة النواة من النسب). ويمكن بسهولة أن تتكيف هذه التقنية لاستخدامها في الفئران مع خلفيات وراثية مختلفة ، على سبيل المثال ، فإننا نستخدم عادة متخالف CX CR 3 / 1 GFP خاصتك X - 1 12 YFP الفئران لتحقيق التفاعل بين الوحيدات المستمدة الضامة ، الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ والخلايا العصبية في النماذج الحية من neuroinflammation ذات الصلة في متناول اليد. استعدادنا TSCW يسمح للمحققين لدراسة الخلية خلية التفاعلات بين المحيط والجهاز العصبي المركزي التي قد تحدث على مدى فترات من أسبوعين ، التي يمكن من خلالها تصوير الحيوان مرارا قبل وبعد العلاج التجريبي. وبالتالي ، يمكن لكل حيوان بمثابة ايقاعه. التحذير واحد لهذا النموذج TSCW هو أن الخلايا المستهدفة في إطار التحقيق بحاجة إلى أن يكون إما وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية محسن (eXFP) أو أن يكون المسمى مع صبغة الفلورسنت دون الإخلال الميكانيكية من القبة ، وأنه يجب أن يكون التعبير eXFP قوية بما يكفي ل تسمح العمارة الخليوي الى أن تصور بعد دورات التصوير المتكرر على مدى فترة من أسابيع.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hospira</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Midazolam hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medetomidine hydrocholoride (Domitor)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pfizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating pads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beyond Bodi Heat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Povidone-iodine 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ferric chloride 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical Company</td>
<td>3120-32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cyanoacrylate 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Permabond</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 454</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtorque II handpiece kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pearson</td>
<td>R14-0002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IRF 007 drill bits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Norland bendable microblade full radius</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salvin Dental</td>
<td>BLAD-NORLAND-69</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The Original Superglue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#0 glass coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>63750-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Microvolume syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>ILS010LT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>UMP3-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 gauge NanoFil needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>NL35BL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ball Mill, Carbide bits #1/4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>SL2-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photomultiplier tube </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>HC125-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ti:Sapphire laser Mai-Tai</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectra-Physics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation

تقليديا في علم الأعصاب في الجسم الحي وقد اشتركت رابطتان التصوير فوتون للنظام العصبي المركزي الفئران إما استخدام مفتوح 1،2 الجمجمة أو ضعفت الجمجمة - 3 التحضيرات. في حين أن الجمجمة المفتوح تقنية متعددة جدا ، فإنه ليس الأمثل لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة لأنها الغازية ويمكن أن يسبب تنشيط دبقية صغيرة. على الرغم من أن نهج ضعفت - الجمجمة مينيملي ، وتكرار إعادة ترقق الجمجمة المطلوبة للتصوير المزمن يزيد من مخاطر الاصابة الأنسجة وتنشيط دبقية صغيرة ويسمح لعدد محدود من جلسات التصوير. هنا نقدم مزمن أسلوب النافذة رقيقة الجمجمة لرصد الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران الحية على مدى فترة طويلة من الوقت باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. نحن لشرح كيفية إعداد وميسرة مستقرة وضعيفة ، الجمجمة النافذة القشرية (TSCW) مع ساترة الزجاج الشفاف الذي لا يزال apposed على مدى ثلاثة اسابيع من المراقبة على فترات متقطعة. هذا التحضير هو أكثر بكثير TSCW خامل مناعيا مع الاحترام لتفعيل دبقية صغيرة من حج القحف أو فتح الجمجمة المتكررة رقيق ويسمح لعدد من جلسات التصوير التعسفي خلال فترة زمنية تصل إلى أسابيع. نحن نستعد TSCW في 3 CX CR + 1 الفئران GFP / 4 لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة مع بروتين الفلورية الخضراء لتعزيز 150 ميكرومتر ≤ تحت سطح حنوني. نعرض أيضا أنه يمكن استخدام هذا الإعداد بالاشتراك مع حقن الدماغ المجسم للبروتين HIV - 1 أعصاب تات ، بجوار TSCW ، وهي قادرة على إحداث microgliosis دائم. ولذلك ، فإن هذه الطريقة مفيدة جدا لدراسة التغيرات في التشكل والحركة دبقية صغيرة مع مرور الوقت في الدماغ الذين يعيشون في نماذج من اضطراب عصبي المرتبطين بفيروس نقص المناعة البشرية (اليد) وغيرها من الأمراض العصبية التي تحتوي على عنصر neuroinflammatory.

Watch this Scientific Journal Video about A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation at JoVE.com

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

نحن تصف طريقة لتصور مرارا الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة وتعميم حيدات<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; على مدى الأيام ، ساعات أو أسابيع باستخدام العابر لاثنين الفوتون المجهري. نحن لشرح كيفية إعداد إطار ضعفت - الجمجمة التي تتيح مراقبة متقطعة من الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة التي يمكن تفعيلها عن طريق الحقن المجسم المتاخمة للتات HIV - 1 البروتين التنظيمية.

تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

ضعفت-الجمجمة وتقنيات النافذة القشرية لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; البصرية بالاتساق التصوير المقطعي التصوير

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

في فيفو الميكروسكوب ثنائي الفوتون من النهايات العصبية في الجلد واحدة

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

الكمي من الشلل الأوعية الدموية العمارة باستخدام ثنائي الفوتون المجهري في نموذج الفأر من Neuroinflammation التي يسببها فيروس نقص المناعة البشرية

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

تصوير الفوتون عبر الحدقة في الجسم الحي لشبكية العين الفأرية

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

زرع نافذة جمجمية للتصوير المتكرر في الجسم الحي في الفئران المستيقظة

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...