Name: quantitation of &gamma;h2ax foci in tissue samples
Uploaded: 2010-06-28T17:33:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of ÃŽÂ³H2AX Foci in Tissue Samples at JoVE.com

Stödet från Australian Institute of Nuclear Science and Engineering är erkänd. TCK var mottagare av AINSE utmärkelser. Epigenomiska Medicin Lab stöds av det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien (566.559). LM stöds av Melbourne Research (University of Melbourne) och biomedicinsk avbildning CRC stipendier kompletterande. Stödet från Monash Micro Imaging (DRS Stephen Cody och ISKA Carmichael) var ovärderlig för detta arbete. MMT är tacksam för sakkunnig hjälp och råd från Dr Olga Sedelnikova från National Institutes of Health.

Vävnader <ol><li> Lungvävnad, inbäddade i formar i optimal kapning temperatur (oktober) förening 4583, var uppställd (5 mikrometer) med hjälp av en CM Leica 1950 kryostat och monteras på poly-L-lysin diabilder. </li></ol> Den frysta togs från Dr Simon Royce på Murdochs Barnens Forskningsinstitut. Lungvävnad erhölls från obehandlade BALB / möss C och från en musmodell för kronisk allergisk luftvägssjukdom som visar många av de patologiska drag av mänskliga astma 6. F...

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+H2AX+and+cancer.">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+residual+gamma-H2AX+foci+in+murine+skin+are+dose+responsive+and+predict+radiosensitivity+in+vivo.">Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo.</a> Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).</li><li>Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-H2AX+as+a+biomarker+of+DNA+damage+induced+by+ionizing+radiation+in+human+peripheral+blood+lymphocytes+and+artificial+skin.">gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin.</a> Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).</li><li>Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+airway+remodeling+in+acute,+subacute,+and+chronic+models+of+allergic+airways+disease.">Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).</li><li>Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li></ol>

För denna demonstration använde vi vävnad musen lungor från obehandlade BALB / möss C och från en musmodell för kronisk allergisk luftvägssjukdom. Vi kvantifieras skillnader i antalet foci per cell med något högre medelvärden som observerats i den skadade lungan jämfört med obehandlade avsnitt. Specifikt anges kvantifiering 6,5 foci per / cell och 9,4 fokus per / cell (manuell räkning av 20 celler per avsnitt), i den obehandlade vävnaden och kronisk allergisk luftvägssjukdom vävnad, respektive. Däremot...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tissue-Tek</td>
<td>4583</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superfrost Plus</td>
<td>Polysine slides</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser, Germany</td>
<td>SF41296SP</td>
<td>Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>655205</td>
<td>Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-phospho-&gamma;H2AX (rabbit polyclonal antibody)</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Upstate, USA</td>
<td>07-164</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-11008</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol (70%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>BSPEL316</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse A</td>
<td>Reagent</td>
<td>Qiagen </td>
<td>19101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield PI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1300</td>
<td>A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. 
Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini PAP Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>008877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser, Germany</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CM Leica 1950 Cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantitation of &gamma;h2ax foci in tissue samples

DNA dubbel-strängbrott (DSBs) är särskilt dödlig och genotoxiska skador, som kan uppstå antingen genom endogena (fysiologiska eller patologiska) processer eller av yttre faktorer, framför allt joniserande strålning och radiomimetiska föreningar. Fosforylering av H2A histon varianten, H2AX på serin-139 rester, i starkt konservativa C-terminal SQEY motiv, bildar γH2AX, är ett tidigt svar på DNA dubbel-strängbrott<sup&gt; 1</sup&gt;. Denna fosforylering händelse förmedlas av fosfatidyl-inosito 3-kinas (PI3K) familj av proteiner, ataxi telangiectasia muterad (ATM), DNA-protein kinas katalytiska subenheten och ATM och RAD3-relaterade (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Sammantaget, vilket DSB induktion leder till bildandet av diskreta kärnkraft γH2AX härdar lätt kan upptäckas och kvantifieras genom immunofluorescens mikroskopi<sup&gt; 2</sup&gt;. Med tanke på den unika specificitet och känslighet för denna markör, analys av γH2AX foci har lett till ett brett spektrum av tillämpningar inom biomedicinsk forskning, särskilt i strålningsbiologi och nuklearmedicin. Kvantifiering av γH2AX foci har mest studerats i cellsystem kultur i samband med joniserande strålning-inducerad DSBs. Bortsett från cellulära strålkänslighet har immunofluorescens baserade analyser också använts för att utvärdera effekten av strålning ändra föreningar. Dessutom har γH2AX använts som en molekylär markör för att undersöka effekten av olika DSB-inducerande ämnen och är nyligen att inledas som viktig markör för åldrande och sjukdom, särskilt cancer<sup&gt; 3</sup&gt;. Vidare immunofluorescens-baserade metoder har anpassats för att passa upptäckt och kvantifiering av γH2AX foci<em&gt; Ex vivo</em&gt; Och<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 4,5</sup&gt;. Här visar vi en typisk immunofluorescens metod för detektion och kvantifiering av γH2AX foci i mus vävnader.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of ÃŽÂ³H2AX Foci in Tissue Samples at JoVE.com

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Kvantifiering av DNA dubbel-strängbrott på grundval av γH2AX foci har blivit ett ovärderligt verktyg, särskilt i strålningsbiologi, för utvärdering av vävnaden strålkänslighet och effekter av strålning ändra föreningar. Här har vi demonstrera användningen av ett immunofluorescens test för kvantifiering av γH2AX foci i vävnadsprover.

Kvantifiering av γH2AX foci i vävnadsprover

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kvantifiering av γH2AX Foci som svar på joniserande strålning

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

NanoDrop Microvolume Kvantifiering av nukleinsyror

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gör-det-själv Device för återhämtning av kryokonserverade prover Tappade misstag i Kryogena Lagringstankar

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Förfarande för att mäta aktiviteten hos Deubiquitinating Enzymer i cellinjer och vävnadsprover

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kvantifiering av endotelceller Vidhäftnings<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Kvantifiering av proteinuttryck och samlokalisering Använda Multiplex Immuno-histokemisk färgning och multispektrala

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Hybrid-Cut: En förbättrad Sektione metod för Motsträviga växtvävnadsprover

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Metoder för att klassificera cytoplasmiska foci som däggdjursstresskorn

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Samtidiga kartläggning och kvantifiering av ribonukleotider i människors mitokondrie-DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Kvantitativa Immunoblotting cellinjer som Standard att validera immunofluorescens för att kvantifiera biomarkör proteiner i rutinmässiga vävnadsprover

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...