Name: diolistic labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices
Uploaded: 2010-07-06T17:00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices at JoVE.com

ברצוננו להודות מיכאל Feyder ו טרל הולוויי על סיועם במהלך ההגדרה הראשונית במעלה של טכניקת מעבדה ד&quot;ר פומי של אונו עבור גישה אל מיקרוסקופ confocal שלהם. מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב באמצעות תוכנית עירונית של NIAAA ו NINDS.

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOLISTIC"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).</li><li>Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+labeling+of+neuronal+populations+by+ballistic+delivery+of+fluorescent+dyes.">Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes.</a> Methods. 30, 79-85 (2003).</li><li>Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+dendritic+spine+formation+in+D1+and+D2+dopamine+receptor-containing+medium+spiny+neurons+in+nucleus+accumbens.">Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).</li><li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin.">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).</li><li>Neely, S. t. a. n. w. o. o. d., Deutch, G. D., Y, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+diOlistic+labeling+with+retrograde+tract+tracing+and+immunohistochemistry.">Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry.</a> J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).</li><li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistics:+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun.">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).</li><li>Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+spine+plasticity+in+cocaine-+withdrawn+rats.">Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats.</a> J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).</li></ol>

הנהלים כל חיה בוצעו בעקבות הדרכה טיפול בבעלי חיים ועדת השתמש ב NIAAA ואת הלאומית אורגון מרכז מחקר הפרימאטים. המחברים אין לחשוף.

תיוג DiOLISTIC הוא אחד המגוונים ביותר טכניקות זמין עבור התאים fluorescently תיוג כי זה יכול להיות מיושם על חלקים רקמות ממינים שונים, למגוון רחב של גילאים, וכדי להשיג רקמה טרי או מקבע-perfused בעלי חיים (ראה גם גן ואח&#39; . 2009). התהליך הוא מהיר יחסית כמו זה לוקח 1-2 ימים וזה יכול להיות בשילוב עם גישות אחרות תיוג קלאסיים יותר כגון immunostaining (Lee et al. 2006). תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם להימנע על תיקון ושימוש ריכוזי חומר ניקוי גבוה פתרונות הדגירה כי אלה יהוו את שלמות הממברנה lipophilic ולגרום לצבוע לדלוף של התאים. חדירה נוגדן יכול להיות בהנחייתם של ריכוזים נמוכים של טריטון X-100 (Lee et al., 2006), כמו גם digitonin או saponin בפתרון הדגירה (Matsubayashi et al. 2008). כמה שינויים כי ניתן ליישם טכניקה זו כוללות את השימוש בכדורי עם צבעים מרובים כפי שתואר על ידי גן et al. (2000) או לשנות את אורך וסוג החשיפה נוגדן (Neely et al. 2009). באופן מסורתי, DiI נעשה שימוש כדי להתחקות אחר תחזיות העצבית במוח. תיוג DiOLISTIC מרחיבה את היישום שלה באמצעות תיאור שיטה שימושית לבדיקת מורפולוגיה התא. מורפולוגיה העצבית מעוררת עניין רב בשל המגוון הגדול נמצא המוח ספקולציות כי צורת התא יכול לחשוב על ריבוי פונקציה של אוכלוסיות נוירונים במערכת העצבים. אחת הדוגמאות לכך היא העובדה כי נוירונים רבים בליטה יונקים מערכת העצבים להציג קטן בשם הקוצים הדנדריטים כי הם באתר של סינפסות glutamatergic. בדרך זו, צפיפות של סינפסות glutamatergic על תא יכול להיות בקורלציה לצפיפות של הקוצים הדנדריטים, אשר ניתן למדוד באמצעות טכניקה תיוג המתוארים כאן. יתר על כן, פרמטרים מורפולוגיים אחרים כגון האורך הכולל דנדריט, דפוס הסתעפות בצורת עמוד השדרה הדנדריטים וצפיפות ניתן לכמת ולמד. השימוש תיוג פלורסנט לחקר המורפולוגיה העצבית יש יתרונות רבים לעומת טכניקות מסורתיות יותר המסתמכים על מיקרוסקופ שדה בהיר (למשל מכתים Golgi) כי זה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה confocal. יתרון נוסף של השימוש DiI כמו fluorophore בניסויים שמטרתם מדידת צפיפות עמוד השדרה הדנדריטים ומורפולוגיה הוא lipophilic המאפיינים שלה. מחיצות DiI לתוך הממברנה פלזמה ומספק מתאר מוגדרים היטב של תהליכים עצביים ועל בליטות הדנדריטים. לאור הנפח הקטן של הקוצים הדנדריטים ביותר (פחות מ 1 femtoliter), מכתים קרום הוא יעיל יותר ומאפשר ראיה טובה יותר, דק יותר מאשר בליטות קטנות מכתים cytoplasmic.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1-1&#x2019;-dioctadecyl-3,3,3&#x2019;,3&#x2019;- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>H485-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2269</td>
<td>1.7 &mu;m diameter</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyvinylpyrrolidone </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>529504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tefzel bullet tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing cutter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2422</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2431</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore membrane filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>3.0 &mu;m pore size</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold Antifade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>30525-89-4</td>
<td>(16% w/v)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

diolistic labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices

מכתים DiOLISTIC משתמש באקדח הגן להציג צבעי ניאון, כגון DiI, לתוך הנוירונים של פרוסות המוח (גן et al, 2009;. אובריין Lummis, 2007; גן et al, 2000).. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של כל צעד נדרש יחד עם תמונות למופת של תוצאות טובות ורעות, שיסייע בעת הגדרת את הטכניקה. מניסיוננו, כמה צעדים הוכיח קריטי עבור יישום מוצלח של DiOLISTICS. שיקולים אלה כוללים את איכות DiI מצופים גומי, היקף החשיפה מקבע, ואת הריכוז של חומר הניקוי המשמשים את פתרונות הדגירה. טיפים ופתרונות לבעיות נפוצות מסופקים. זוהי טכניקה תיוג צדדי כי ניתן להחיל על בעלי חיים מרובים בו מגוון רחב של גילאים. שלא כמו אחרים בטכניקות תיוג פלורסנט כי מוגבלים ההכנות של בעלי חיים צעירים או מוגבלת עכברים, כי הם מסתמכים על הביטוי של transgene ניאון, תיוג DiOLISTIC ניתן להחיל על בעלי חיים מכל הגילאים, המינים גנוטיפים וזה יכול להיות בשילוב עם immunostaining לזהות subpopulation מסוימים של תאים. כאן אנו מדגימים את השימוש DiOLISTICS לנוירונים התווית פרוסות המוח של עכברים בוגרים ומבוגרים שאינם בני אדם פרימטים במטרה לכימות דנדריט הסתעפות ומורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים.

Watch this Scientific Journal Video about DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices at JoVE.com

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

אנו מדגימים את השימוש באקדח הגן להציג צבעי ניאון, כגון DiI, לתוך הנוירונים פרוסות המוח של מכרסמים פרימטים שאינם בני אדם בגילאים שונים. במקרה הספציפי הזה, אנו משתמשים בעכברים בוגרים (3-6 חודשים) וקופים cynomologus מבוגר (9-15 שנים). טכניקה זו, שתוארה לראשונה על ידי במעבדה של ד&quot;ר ליכטמן (גן<em&gt; ואח&#39;</em&gt;., 2000), הוא גם מתאים ללימוד הסתעפות הדנדריטים ומורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים ניתן לשלב עם immunostaining המסורתית, אם דטרגנטים נשמרים בריכוז נמוך.

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

הקלטה של אפנון של הפעילות פרוסות המוח מכרסמים מצמידים מערכים Microelectrode

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...