Name: diolistic labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices
Uploaded: 2010-07-06T17:00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Майкла Feyder и Террелл Холлоуэй за помощь во время начальной настройки техники и лаборатории доктора Фуми Ono с для доступа к своим конфокальной микроскопии. Это исследование было профинансировано Национальным институтом здравоохранения через очной программе NIAAA и NINDS.

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOLISTIC"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).</li><li>Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+labeling+of+neuronal+populations+by+ballistic+delivery+of+fluorescent+dyes.">Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes.</a> Methods. 30, 79-85 (2003).</li><li>Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+dendritic+spine+formation+in+D1+and+D2+dopamine+receptor-containing+medium+spiny+neurons+in+nucleus+accumbens.">Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).</li><li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin.">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).</li><li>Neely, S. t. a. n. w. o. o. d., Deutch, G. D., Y, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+diOlistic+labeling+with+retrograde+tract+tracing+and+immunohistochemistry.">Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry.</a> J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).</li><li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistics:+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun.">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).</li><li>Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+spine+plasticity+in+cocaine-+withdrawn+rats.">Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats.</a> J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).</li></ol>

Все животные процедуры были выполнены следующие указания уходу и использованию животных комитетом на NIAAA и Орегон Национальная Предстоятель Research Center. Авторы не имеют ничего разглашать.

DiOLISTIC маркировка является одним из наиболее универсальных методов, доступных для флуоресцентной маркировки клетки, поскольку она может быть применена к срезах тканей из разных видов, широкий диапазон возрастов, а также ткани, полученной из свежих или фиксатором-перфузии животных (см. также Ган и др. ., 2009). Процесс относительно быстро, как это занимает 1-2 дней, и он может быть объединен с другими, более классической маркировки подходы, такие как иммунное (Lee и соавт., 2006). Особое внимание следует уделить, чтобы избежать чрезмерной фиксации и использование высоких концентраций детергентов в инкубации, потому что эти решения будет состоять целостности липофильные мембраны и вызывать красителя к утечке из клетки. Антитела проникновения может способствовать низкие концентрации Тритон Х-100 (Lee и соавт., 2006), а также дигитонин или сапонина в инкубационном растворе (Matsubayashi и соавт., 2008). Некоторые изменения, которые могут быть применены к этой технике относятся использование пули с несколькими красителями, как описано в Гане и соавт. (2000) или изменение длины и типа антител экспозиции (Нили и соавт., 2009). Традиционно, DII была использована для определения проекций нейронов в головном мозге. DiOLISTIC маркировка расширяет его применение с описания метода целесообразно рассмотреть морфологии клеток. Нейронные морфологии представляет большой интерес из-за большого разнообразия в мозге и предположение, что формы клеток могли бы отразиться на функции кратности нейронных популяций в нервной системе. Одним из примеров этого является тот факт, что многие нейроны в нервной системе млекопитающих отображения небольших выступов называемых дендритных шипиков, которые сайт глутаматергической синапсов. Таким образом, плотность синапсов глутаматергической на ячейке может быть соотнесена с плотностью дендритных шипиков, которая может быть измерена с помощью маркировки методике, описанной в настоящем документе. Кроме того, другие морфологические параметры, такие как общая длина дендритов, ветвления, дендритные формы позвоночника и плотность может быть определена количественно и изучены. Использование флуоресцентной маркировки для изучения морфологии нейронов имеет много преимуществ по сравнению с более традиционными методами, которые опираются на яркие микроскопии области (например Гольджи окрашивание), поскольку он позволяет более высокое разрешение конфокальной микроскопии. Еще одним преимуществом использования DII как флуорофора в экспериментах, направленных на измерение плотности дендритных позвоночника и морфология является его липофильные свойства. DII перегородками на плазматической мембраны и обеспечивает также определены контуры нейронных процессов и дендритных выступов. Учитывая небольшой объем наиболее дендритных шипиков (менее 1 femtoliter), мембранного окрашивания является более эффективным и позволяет лучше визуализировать небольшие, тонкие выступы, чем цитоплазматические окрашивания.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1-1&#x2019;-dioctadecyl-3,3,3&#x2019;,3&#x2019;- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>H485-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2269</td>
<td>1.7 &mu;m diameter</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyvinylpyrrolidone </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>529504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tefzel bullet tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing cutter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2422</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2431</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore membrane filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>3.0 &mu;m pore size</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold Antifade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>30525-89-4</td>
<td>(16% w/v)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

diolistic labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices

DiOLISTIC окрашивания использует генной пушки ввести флуоресцентными красителями, например, DII, в нейроны головного мозга ломтиками (Ган и др., 2009;. О&#39;Брайен и Ламмис, 2007; Ган и др., 2000.). Здесь мы предлагаем подробное описание каждого шага необходимо вместе с образцовой образы хороших и плохих результатов, которые помогут при создании техники. По нашему опыту, в нескольких шагах доказал решающее значение для успешного применения DiOLISTICS. Эти соображения включают качество DII пулями, степень воздействия фиксатора, и концентрация моющего средства в инкубационном решений. Советы и решения общих проблем предоставляются. Это универсальный метод маркировки, которые могут быть применены к нескольким видам животных в широком диапазоне возрастов. В отличие от других флуоресцентных методов маркировки, которые ограничены препаратов из молодых животных или ограниченных для мышей, потому что они полагаются на выражение флуоресцентные трансгенов, DiOLISTIC маркировки может быть применена к животным всех возрастов, видов и генотипов, и он может быть использован в сочетании с иммуноокрашивания определить конкретные субпопуляции клеток. Здесь мы демонстрируем использование DiOLISTICS маркировать нейронов в мозге ломтики от взрослых мышей и взрослых без человеческих приматов с целью количественной дендритов ветвление и дендритных морфологии позвоночника.

Watch this Scientific Journal Video about DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices at JoVE.com

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Мы демонстрируем использование генной пушки ввести флуоресцентными красителями, например, DII, в нейроны в мозге ломтики от грызунов и не-человеческое приматов разных возрастов. В данном конкретном случае мы используем взрослых мышей (3-6 месяцев) и взрослых cynomologus обезьян (9-15 лет). Этот метод, впервые описана в лаборатории доктора Лихтман (Ган<em&gt; И др.</em&gt;., 2000), хорошо подходит для изучения дендритных ветвлений и дендритные морфологии позвоночник и может сочетаться с традиционными иммуноокрашивания, если моющие средства хранятся в низкой концентрации.

DiOLISTIC Маркировка нейроны от грызунов и не-человека Предстоятель фрагменты мозга

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation нейронов из кусочков мозга грызунов по изучению синаптической передачи изображения и пресинаптические терминалы

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Изображениями кальция Ответы на GFP с метками нейроны гипоталамуса фрагменты мозга мыши

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Напряжение чувствительные краски Запись с аксонов, дендритов и дендритных шипиков отдельных нейронов в срезах мозга

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Выращивание нервные стволовые клетки из обычных и нетрадиционных областях мозга взрослых грызунов

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Изоляция, культуры и долгосрочного поддержания первичного теменной дофаминергических нейронов из эмбриональных грызунов Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Получение нечеловеческих приматов ткани головного мозга для предварительного внедрения иммуногистохимии и электронной микроскопии

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Применение автоматизированного патч-зажима для изображений для изучения нейронов в средах мозга

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Оценка плотности синапсов в срезах гиппокампа грызунов мозга

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Изоляция и извлечение RNA нейронов, макрофаги и микроглии от личинок данио рерио мозги

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Запись и модуляция активности эпилептиформный ломтиками грызунов мозга в сочетании с микроэлектродные массивы

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...