Name: rhoc gtpase activation assay
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00
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US-Verteidigungsministerium W81XWH-05-1 bis 0005, W81XWH-06-1 bis 0495, W81XWH-08-1 bis 0029 und W81XWH-08-1 bis 0356

1. Bereiten Sie GST-Fusionsprotein <ol><li> Glycerol Bestände JM109 kompetente Bakterien mit den ersten N-terminalen 90 Aminosäuren des rhotekin Rho-Bindungsdomäne (RBD) in die BamH1/EcoR1 pGEX3x subkloniert sind. Um eine hohe Effizienz der folgenden Schritte müssen für jedes Experiment durchgeführt werden. In unserer Erfahrung, frisch zubereitete GST-RBD ist der Schlüssel, um eine robuste und präzise GTPase-Aktivierungs-Assay. </li><li> Dann werden 50 ul (ungefähre, nicht auftauen) Glycerin Lage...

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	<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoC+GTPase,+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype.">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells.">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li><li>Golen, K. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor.">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li><li>Golen, K. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility,+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer.">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li><li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility.">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li><li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+Collagen+receptor+(alpha2beta1)+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase.">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li><li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology,+invasion+and+tumor+cell+diapadesis.">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li><li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac.">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li><li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Int J Cancer. , (2010).</li><li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+downregulates+Rho+activity:+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior.">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li></ol>

Der wichtigste Schritt des Verfahrens ist die Erzeugung von frischen GST-RBD. Andernfalls Aufmerksamkeit, um diesen Schritt zu zahlen ist Hauptgrund für das Scheitern. Alle Schritte, von der Generation der GST-RBD (1,2), die Inkubation über Nacht mit dem Zelllysat (2,5), sollte an einem einzigen Tag durchgeführt werden. Ein weiterer entscheidender Schritt ist, um sicherzustellen, dass es genügend Zellen zu den Zelllysaten zu produzieren. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn man RhoC GTPase, die anwesend zu sein i...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<tr>
<td>Gluthione-sepharose 4B beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0756-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Criterion 4-20% Tris-HCl gels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>345-0032</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rhoc gtpase activation assay

RhoC GTPase hat 91% Homologie zu RhoA GTPase. Aufgrund der Prävalenz in den Zellen haben viele Reagenzien und Techniken für RhoA GTPase entwickelt worden. Allerdings ist RhoC GTPase in metastasierenden Krebszellen auf relativ niedrigem Niveau exprimiert. Deshalb haben einige RhoC-spezifische Reagenzien entwickelt worden. Wir haben eine Rho-Aktivierungs-Assay angepasst RhoC GTPase zu erkennen. Diese Technik nutzt eine GST-Rho-bindende Domäne Fusionsprotein herausziehen aktive RhoC GTPase. Darüber hinaus können wir insgesamt Protein zu Beginn des Tests Ernte auf ein Niveau von insgesamt (GTP und GDP gebunden) RhoC GTPase zu bestimmen. Dies ermöglicht die Bestimmung des aktiven und totale RhoC GTPase in der Zelle. Mehrere kommerzielle Versionen von diesem Verfahren wurden jedoch entwickelt, sind die kommerziellen Kits für RhoA GTPase optimiert und in der Regel nicht gut für RhoC GTPase. Teile des Tests wurden ebenso wie die Entwicklung eines RhoC-spezifischen Antikörper modifiziert.

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RhoC GTPase Activation Assay

Dieses Protokoll verwendet einen Pull-Down-Assay auf das Niveau der aktiven RhoC GTPase innerhalb der Zellen zu bestimmen.

RhoC GTPase-Aktivierungs-Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Interview: Glycolipid Antigen Presentation by CD1d and the Therapeutic Potential of NKT cell Activation

Interview: Glycolipid Antigen-Präsentation durch CD1d und das therapeutische Potenzial von NKT Zellen-Aktivierung

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious ...

Forschung

Biologie

Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Recordings of Neural Circuits Aktivierung in Frei Behaving Tiere

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

Aortic Ring Assay

Aorten-Ring-Test

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from preexisting vasculature is associated with both natural and pathological processes. Various angiogenesis ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Intracellular Refolding Assay

Intrazelluläre Rückfaltung Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch &amp; MALDI-TOF-Massenspektrometrie Analyse der PAK2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...