Name: rhoc gtpase activation assay
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00
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防衛W81XWH - 05 - 1 - 0005、W81XWH - 06 - 1から0495まで、W81XWH - 08 - 1から0029とW81XWH - 08 - 1から0356までの部

1。 GST -融合タンパク質を準備<ol><li> BamH1/EcoR1 pGEX3xベクターにサブクローニングrhotekinのRho結合ドメイン（RBD）の最初のN末端90アミノ酸を含むJM109コンピテント細菌のグリセロールストックが行われます。 高効率を確保するために、次の手順は、各実験のために実行しなければなりません。我々の経験では、新しく調製したGST - RBDは、堅牢で正確な分子量GTPase活性化アッセイの鍵と?...

<ol>
	<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoC+GTPase,+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype.">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells.">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li><li>Golen, K. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor.">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li><li>Golen, K. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility,+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer.">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li><li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility.">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li><li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+Collagen+receptor+(alpha2beta1)+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase.">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li><li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology,+invasion+and+tumor+cell+diapadesis.">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li><li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac.">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li><li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Int J Cancer. , (2010).</li><li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+downregulates+Rho+activity:+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior.">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li></ol>

手順の最も重要なステップは、新鮮なGST - RBDの世代です。このステップに細心の注意を払うために失敗は失敗の主な理由です。すべてのステップは、細胞溶解液（2.5）で一晩インキュベーションにGST - RBD（1.2）の世代から、一日で行う必要があります。もう一つの重要なステップは、細胞ライセートを生成するために十分な細胞があることを一定にすることです。セル内の低いレベルで存在?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gluthione-sepharose 4B beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0756-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Criterion 4-20% Tris-HCl gels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>345-0032</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rhoc gtpase activation assay

RhoC GTPアーゼは、RhoAのGTPアーゼ〜91％の相同性を持っています。ために細胞内での有病率から、RhoAのGTPアーゼのための多くの試薬および技術が開発されている。しかし、RhoC GTPアーゼは、比較的低レベルでの転移性癌細胞に発現している。したがって、少数のRhoC固有の試薬が開発されている。私たちはRhoC低分子量GTPaseを検出するためのRho活性化アッセイを適応している。この手法は、アクティブなRhoC GTPアーゼを引き出すためにGST - Rhoの結合ドメイン融合タンパク質を利用しています。さらに、我々は全体のレベル（GTPおよびGDP結合）RhoCのGTPアーゼを決定するアッセイの開始時に総タンパク質を収穫することができます。これは、セル内のアクティブな対総RhoC GTP加水分解酵素の測定が可能になります。この手順のいくつかの商用バージョンがしかし、市販のキットはRhoAのGTP加水分解のために最適化されており、通常はRhoC GTPアーゼのためにうまく動作しない開発されています。アッセイの部分はRhoC特異的抗体の開発だけでなく、変更されています。

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RhoC GTPase Activation Assay

このプロトコルは、細胞内のアクティブなRhoC低分子量GTPaseのレベルを決定するためにプルダウンアッセイを利用しています。

RhoC GTPアーゼ活性化アッセイ

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

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