Name: rhoc gtpase activation assay
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RhoC GTPase Activation Assay at JoVE.com

Кафедра обороны W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 и W81XWH-08-1-0356

1. Подготовка GST-синтез белка <ol><li> Глицерин запасы JM109 компетентных бактерий содержащий первые N-терминал 90 аминокислот rhotekin Rho связывающий домен (РосБР) субклонировали BamH1/EcoR1 pGEX3x вектора сделаны. Чтобы убедиться в высокой эффективности следующие шаги должны быть выполнены для к...

<ol>
	<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoC+GTPase,+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype.">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells.">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li><li>Golen, K. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor.">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li><li>Golen, K. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility,+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer.">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li><li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility.">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li><li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+Collagen+receptor+(alpha2beta1)+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase.">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li><li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology,+invasion+and+tumor+cell+diapadesis.">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li><li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac.">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li><li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Int J Cancer. , (2010).</li><li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+downregulates+Rho+activity:+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior.">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li></ol>

Наиболее критичным этапом процедуры является генерация свежих GST-РосБР. Невыполнение обратить пристальное внимание на этот шаг является основной причиной для отказа. Все шаги, от поколения GST-RBD (1.2) для инкубации в течение ночи с Клеточный лизат (2,5), должно быть сделано в течение одного ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gluthione-sepharose 4B beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0756-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Criterion 4-20% Tris-HCl gels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>345-0032</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rhoc gtpase activation assay

RhoC GTPase имеет 91% гомологию с RhoA ГТФ. Из-за своей распространенности в клетках, многие реактивы и методики RhoA GTPase были разработаны. Тем не менее, RhoC GTPase выражается в метастатические раковые клетки при относительно низких уровнях. Таким образом, несколько RhoC-специфических реагентов были разработаны. Мы адаптировали анализа Rho активации для обнаружения RhoC ГТФ. Эта техника использует GST-связывающий белок Rho слияние домена вытащить активных GTPase RhoC. Кроме того, мы можем урожай общего белка в начале анализа для определения уровня общего (ГТФ и ВВП граница) RhoC ГТФ. Это позволяет для определения активной по сравнению с общим RhoC ГТФ в клетке. Несколько коммерческих версий этой процедуры были разработаны однако, коммерческие наборы, оптимизированные для RhoA ГТФ и, как правило, не работают хорошо для RhoC ГТФ. Части анализа были изменены, а также развитие RhoC-специфических антител.

Watch this Scientific Journal Video about RhoC GTPase Activation Assay at JoVE.com

RhoC GTPase Activation Assay

Этот протокол используется выпадающее анализ, чтобы определить уровень активной RhoC ГТФ внутри клеток.

RhoC GTPase Активация Пробирной

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Interview: Glycolipid Antigen Presentation by CD1d and the Therapeutic Potential of NKT cell Activation

Интервью: Презентация гликолипид антигена CD1d и терапевтический потенциал активации ячейки NKT

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious ...

Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Записи Нейронные Активация округу в свободно Поведение животных

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

Aortic Ring Assay

Аортального кольца Пробирной

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from preexisting vasculature is associated with both natural and pathological processes. Various angiogenesis ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Выделение и В пробирке Активация Caenorhabditis Элеганс Сперма

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Активация апоптоза Цитоплазматическая Микроинъекция цитохрома С</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Intracellular Refolding Assay

Внутриклеточное Пробирной рефолдинг

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Амид водород / дейтерий бирже и MALDI-TOF масс-спектрометрии Анализ Pak2 активации

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Одиночных молекул изображений регуляции генов<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Использование Cotranslational активацию путем расщепления (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. Элеганс Анализ хемотаксиса

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

Сравнение сродства GTPase-связывающих белков, используя конкурентных анализах

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...