Name: studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels
Uploaded: 2010-08-10T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels at JoVE.com

Arbete är vårt laboratorium stöds med bidrag från National Institutes of Health.

Förberedelser <ul><li> Täckglas skall autoklaveras. </li><li> Sterilt destillerat eller avjoniserat vatten bör användas för att förbereda lösningar och för tvätt täckglas. </li><li> AC (40% w / v) och bis-AC (1% w / v) lösningar är steriliserade med 0,2 ìm filtrering. Förbered 10% ammonium persulfate (APS, 100μg/ml vatten) strax före användning och sterila filter. Byt APS lösning månad. </li><li> Kemiska reagenser som 3-APTMS, kloroform, glutaradehyde, NHS, och SurfaSil som inte kan autoklaveras hå...

<ol>
	<li>Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+analysis+of+heterogeneous,+atherosclerotic+human+aorta.">Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta.</a> J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).</li><li>Bernini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+stiffness,+intima-media+thickness+and+carotid+artery+fibrosis+in+patients+with+primary+aldosteronism.">Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism.</a> J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).</li><li>Boonyasirinant, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+stiffness+is+increased+in+hypertrophic+cardiomyopathy+with+myocardial+fibrosis:+novel+insights+in+vascular+function+from+magnetic+resonance+imaging.">Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging.</a> J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis.">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li><li>Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+mechanical+properties+of+human+atherosclerotic+tissue+by+high-frequency+intravascular+ultrasound+imaging.+An+in+vitro+study.">Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study.</a> Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).</li><li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li><li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li><li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues:+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples.">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples.</a> Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).</li><li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior.">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).</li><li>Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion,+cellular+tension,+and+cell+cycle+control.">Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control.</a> Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).</li><li>Klein, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+control+by+physiological+matrix+elasticity+and+in+vivo+tissue+stiffening.">Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening.</a> Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).</li></ol>

En avgörande del av hydrogel polymerisation processen är att undvika att luft bubblor bildas som gör att cellerna binder till glaset täckglas stället för ECM-belagda hydrogel själv. Detta kan förhindras genom att försiktigt pipettera den polymerisation lösning efter vortexa och visuellt se till att inga luftbubblor har blivit fångade i gelen. Vi rekommenderar alltid att förbereda ytterligare &quot;reaktiv&quot; täckglas och hydrogeler att se till att ha tillräckligt för experiment. <p class="jove_cont...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glutaraldehyde, 70%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G7776</td>
<td>Store at -20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>281778</td>
<td>Store at room temperature</td>
</tr>
<tr>
<td>SurfaSil Siliconizing Fluid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>42800</td>
<td>Store at room temperature</td>
</tr>
<tr>
<td>NHS (N-hydroxysucinimide Ester)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A-8060</td>
<td>Store at 4&deg;C Replace monthly</td>
</tr>
<tr>
<td>Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A6003-100G</td>
<td>Store at 4&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Coverslips (25mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-86 25 Cir 1D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (18mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-84 18 Cir 1D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels

Tissue styvhet är en viktig faktor för cellulär funktion, och förändringar i vävnaden styvhet är vanligen associerat med fibros, cancer och hjärt-kärlsjukdom 1-11. Traditionella cellbiologiska metoder för att studera cellfunktioner innebär odling celler på ett styvt underlag (plastskålar eller täckglas glas) som inte kan kompensera för inverkan av en elastisk ECM eller variationer i ECM styvhet mellan vävnader. Att modellera in vivo-förhållanden vävnad efterlevnad in vitro, vi och andra använder ECM-belagda hydrogel. I vårt laboratorium, är hydrogeler baseras på polyakrylamid som kan härma olika vävnader efterlevnad sett biologiskt 12. &quot;Reaktiv&quot; täckglas genereras genom inkubering med NaOH följt av tillägg av 3-APTMS. Glutaraldehyd används för att länka till 3-APTMS och polyakrylamidgel. En lösning av akrylamid (AC), bis-akrylamid (Bis-AC) och ammonium persulfate används för polymerisation av hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) har införlivats med AC lösningen Crosslink ECM protein till hydrogel. Efter polymerisation av hydrogel är gelen ytan belagd med en ECM protein val som fibronektin, vitronektin, kollagen, etc. Styvheten i en hydrogel kan fastställas genom reologi eller atomkraftsmikroskopi (AFM) och justeras genom att variera andelen AC och / eller bis-AC i lösningen 12. På detta sätt kan underlaget stelhet anpassas till styvheten i biologisk vävnad som också kan kvantifieras med hjälp av reologi och AFM. Celler kan sedan seedade på dessa hydrogeler och odlade baserat på krävs experimentella förhållanden. Avbildning av celler och deras återhämtning för molekylär analys är enkel. För den här artikeln definierar vi mjuka substrat som de som har elastiska böjmotståndet (E) &lt;3000 Pascal och styva substrat / vävnader som de med E&gt; 20.000 Pascal.

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels at JoVE.com

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Effekten av substrat stelhet på cellulär funktion kan modelleras<em&gt; In vitro</em&gt; Hjälp polyakrylamid hydrogeler av varierande efterlevnad.

Studera effekter av Matrix Stelhet på cellulär funktion med Akrylamid-baserade Hydrogeler

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Mikroinjektion Tekniker för att studera Mitos i Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

Cellular Inkapsling i 3D Hydrogeler för tissue engineering

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

Mätning av böjstyvhet i bakterieceller med en optisk Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

Identifiera Effekter av BRCA1 mutationer på homolog rekombination med hjälp av celler som uttrycker Endogent vildtyp-BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Analysera funktion Små GTPases genom mikroinjektion av plasmider till Polarized epitelceller

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Visualisering av mitokondrie lungfunktion med hjälp av cytokrom C Oxidas / succinatdehydrogenas (COX / SDH) Dubbelklicka märkning Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Skapa Definierade Gasformiga miljöer för att studera effekterna av Hypoxi på<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Mätning av effekterna av bakterier på<em&gt; C. Elegans</em&gt; Beteende användning av en analys Egg Retention

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Mätning av styvheten hos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aorta Använda atomkraftsmikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Tekniker för att inducera och kvantifiera cellulärt åldrande

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...