Name: multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation
Uploaded: 2010-09-20T17:00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation at JoVE.com

אנו מבקשים להודות לד&quot;ר. למירה סאקסנה ויונתן מתיאס על הערות מועילות על כתב היד. אנו מודים בני הזוג. מייקל פרסונס, פמלה ריימונד, ורחל וונג לאספקת קווי מהונדס. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי IACUC מק&quot;ג אושר פרוטוקול 07-12-003 * B. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21 MH083614 ו מצעד הפרוטות פרס בזיל O האשכול Scholar קונר כדי JSM

<ol>
	<li>K&#246;ster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+microscopy+of+brain+development.">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li><li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells.">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li><li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li><li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish.">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li><li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

JSM זכתה פטנט על השימוש במערכת nitroreductase המבוסס על אבלציה של תא דג הזברה (השמפניה JS, ו שרוטר, EH אבלציה אבלציה ממוקדים האזורית נייד של דג הזברה &quot;פטנט אמריקאי 7514595. 7 אפריל 2009). טכניקה זו משמש פלטפורמה הרחב כלים ושירותים חברת הביוטכנולוגיה, Luminomics, Inc, אשר נוסדה JSM ונשאר בעל עניין בה

בסרטון הזה, סקירה של טכניקות אנו משתמשים עבור הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופק. אנו מעסיקים זמן לשגות הדמיה לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של עניין in vivo, בעוד אבלציה תא ממוקד משמש ללמוד לתפקד מעגלים עצביים תא ספציפי פרדיגמות התחדשות הנוירונים. הדוגמאות הראו להדגיש כמה יתרונות כי ניתן ללמוד מן הגישות הללו. אולי הכי משמעותי, זמן לשגות הדמיה מספקת הפרדיגמה נשלטת פנימי; פי כל התופעות שנצפו יכול להיות קשור אל מדינות הקודם. זה מאפשר השוואה ישירה ולא להסיק להתבצע על פני נקודות זמן הניסוי, ביצוע שינויים יחסית קל לכמת והפחתת &#39;רעש&#39; ניסיוני הקשורים וריאציות בתוך אוכלוסיה. היתרון של ססגוניות הדמיה היא היכולת לחזות שינויים אינטראקציה ו / או סוגי תאים סמוכים. למשל, באמצעות קו מהונדס אשר תוויות גליה Müller, אנו נמצאים כעת המאפיינת את התגובה של אלה פגיעה הנגרמת תאים פוטנציאל גזע לאובדן בדידה subpopulations תא הרשתית. יש לנו גם השתמשו בגישה זו כדי להגדיר מנגנוני הרומן של היווצרות מעגלים עצביים 2. לבסוף, בנוסף מחקרים של התחדשות התאים, התחלנו לאחרונה באמצעות מערכת NTR מבוססי אבלציה כדי לחקור את תפקיד פונקציונלי של תת העצבית ובכך מעגלים עצביים נפרדים באמצעות פרדיגמות התנהגותיים שונים מבחני אלקטרו. היתרון הייחודי של העסקת דג הזברה של מחקרים כאלה היא, כי בשל יכולת ההתחדשות שלהם, גירעונות המושרה הן זמניות. לכן, על ידי correlating עם זמן לשגות מבחני הדמיה נוכל מאפיינות מנגנוני reinnervation להוביל, כמו גם את מידת reinnervation הנדרש להתאוששות, פונקציונלי. שיטות סיפק ניתן להתאים שאלות רבות ושונות. למשל, ניתוח דומה של אבלציה והתחדשות יכול להיות מיושם על כל תת הסלולר definable transgenically. ביחד, מחקרים כאלה יש פוטנציאל להרחיב את ההבנה שלנו של התחדשות ברמה של סוגי תאים בודדים בתוך נישות תא גזע נפרד.

1. ריאגנטים: Danieau של פתרון: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתרן כלורי (פישר, S271 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשלגן כלורי (פישר, P217 500) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HEPES (פישר, BP310500) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגנזיום סולפט (פישר, M65 500) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סידן חנקתי (פישר, C109500) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פניצילין, סטרפטומיצין (פישר, ICN1670049) </li></ul> ריאגנטים נוספים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נמוכה להמיס agarose (פישר, BP165-25) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tricane methanesulfonate (פישר, NC9435281) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> N-phenylthiourea (פישר, NC9968868) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Metronidazole (פישר, AC21034-1000) </li></ul> 2. ציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק צלחות פטרי, (פישר סיינטיפיק / קורנינג, 08-772-32) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דומון # 5 מלקחיים קנס (פישר, NC9404145) </li></ul> 3. ציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זום Stereoscope (אולימפוס, SZ51) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluorescence Stereoscope זום (אולימפוס, SZX16) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ Confocal (אולימפוס FV1000) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Digital דוד בלוק - Isotemp (פישר, 11-715, 125DQ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Barnstead / Thermolyne benchtop החממה (פישר, 11-702-4). </li></ul>

multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation

הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות של דג הזברה זחלים חיים יכול להיות מנוצל כדי להמחיש כיצד תהליכים ביולוגיים להתפתח (לסקירה ראה 1). דג מהונדס מתחם המבטאים כתבים ניאון שונה בסוגי תאים שכנים לספק אמצעי הבאים אינטראקציות הסלולר 2 ו / או רקמות ברמה התגובות מניפולציות ניסיוני לאורך זמן. בסרטון הזה אנחנו מדגימים שיטות שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה סוגים שונים בתא שכותרתו transgenically סדרתי על קורסים הזמן יכולה להקיף מ דקות עד מספר ימים דגים בודדים. הטכניקות המתוארות החלות על כל המבקשים ללמוד לקשר בין &quot;התנהגות&quot; של סוגי תאים שכנים לאורך זמן, כולל: &quot;לתפוס ולשחרר &#39;1) סדרתי שיטות הדמיה מספר גדול של דגים על פני ימים רצופים, 2) גישות פשוטה עבור הפרדת fluorophores עם עירור / פליטה פרופילים חופפים (למשל, ה-GFP ו YFP), 3) שימוש קווים מוטנטים hypopigmented להרחיב את חלון הזמן הפנוי הדמיה ברזולוציה גבוהה לתוך הזחל בשלבים המאוחרים של התפתחות, 4) שימוש קרום ממוקד כתבים פלורסנט לחשוף פרט מורפולוגיים קנס של תאים בודדים, כמו גם פרטים הסלולר באוכלוסיות גדולות של תאים, ו 5) שיטה שתואר לעיל עבור אבלציה כימית-Induced של סוגי תאים ממוקד transgenically, כלומר nitroreductase (NTR) המרה בתיווך של מצעים prodrug, כמו metronidazole (MTZ), כדי נגזרים ציטוטוקסיות 3,5. כדוגמה הגישות הללו, נוכל לדמיין את אבלציה והתחדשות של תת סוג של הרשתית דו קוטבית נוירון בתוך דגים בודדים על פני כמה ימים. במקביל נוכל לעקוב אחר מספר סוגי תאים ברשתית, כולל הלא ממוקד תאים שכנים דו קוטבית פוטנציאל ניוון-גירוי בתאי גזע הרשתית (כלומר, גליה Mϋller). אסטרטגיה זו מוחל במעבדה שלנו לאפיין תאים ורקמות ברמה (למשל, תא גזע נישה) תגובות לאובדן התחדשות סלקטיבית של סוגי תאים עצביים ממוקד.

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation at JoVE.com

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של עניין<em&gt; In vivo</em&gt;. אבלציה תא ממוקד מאפשר המעגל העצבי ללמוד לתפקד תא ספציפי פרדיגמות התחדשות הנוירונים.

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generation of Human CD40-activated B cells

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

הגורל מיפוי בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי גיבוש תפלצת

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

דור של הטרנסגניים<em&gt; הידרה</em&gt; על ידי Microinjection העובר

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...