Name: a method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00
Duration: 17 min 42 s
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	<li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+as+a+treatment+for+diabetes.">Islet transplantation as a treatment for diabetes.</a> J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).</li><li>Gangemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+for+brittle+type+1+diabetes:+the+UIC+protocol.">Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol.</a> Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).</li><li>Zmuda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+ATF3,+an+adaptive-response+gene,+protects+islets+and+ameliorates+inflammation+in+a+syngenic+transplantation+model.">Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model.</a> Diabetologia. , (2010).</li><li>Bottino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Human+Islets+to+Isolation+Stress+and+the+Effect+of+Antioxidant+Treatment.">Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment.</a> Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).</li><li>Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+islet+cell+culture+in+vitro+at+24+degrees+C+on+graft+survival+and+MHC+antigen+expression.">The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression.</a> Transplantation. 49, 272-277 (1990).</li><li>Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cyclosporin-A,+low-temperature+culture,+and+anti-Ia+antibodies+on+prevention+of+rejection+of+rat+islet+allografts.">The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts.</a> Diabetes. 35, 83-88 (1986).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival.">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li><li>Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STZ+transport+and+cytotoxicity.+Specific+enhancement+in+GLUT2-expressing+cells.">STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells.</a> Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).</li><li>Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+in+osmolality+and+range+of+density+of+a+continuous+ficoll-sodium-diatrizoate+gradient+for+isopycnic+purification+of+isolated+human+islets.">Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets.</a> Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).</li><li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts.">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li><li>Nasr, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+Immune+Privilege+Promotes+Transplantation+Tolerance+by+Altering+the+Balance+between+Memory+and+Regulatory+T+Cells.">Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells.</a> J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).</li><li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation.">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).</li><li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats.">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li></ol>

Dans les sections ci-dessus, nous avons décrit les étapes détaillées pour l&#39;isolement et la transplantation des îlots pancréatiques de souris. Ici, nous brièvement les étapes qui sont critiques pour le succès de la procédure. 1. L&#39;isolement Islet Les principales étapes sont l&#39;identification d&#39;un temps de digestion enzymatique optimale (1,4), le positionnement de la pince hémostatique sur l&#39;ouverture du duodénum du canal cholédoque (2.2.3), cannulating le cholédoque (2,3), une agitation vigoureuse du pancréas après le 37 ° C Digest (3,2), et la suppression de la contamination de cellules exocrines (3.3.7 et 3.3.16). Ces mesures ont une influence considérable sur la qualité, le rendement et la pureté des îlots. Peut-être l&#39;étape la plus difficile techniquement est la canulation du canal cholédoque. Dans beaucoup de souris, le canal cholédoque peut être difficile à visualiser en raison de fascia environnant. Par conséquent, il est fréquent que les tentatives de cathétériser le résultat du cholédoque dans la pénétration du tissu du fascia seulement. Dans ces cas, le Libérase commence à remplir le tissu conjonctif environnant et ne perfuser le pancréas. Si cela est observé, arrêter l&#39;écoulement de Libérase et repositionner l&#39;aiguille de sorte qu&#39;elle pénètre dans la lumière de la voie biliaire. Avec la pratique, il est possible d&#39;identifier rapidement la position optimale pour le placement d&#39;aiguilles et de compléter la canulation sans endommager le conduit friable. 2. La transplantation d&#39;îlots Les étapes essentielles sont l&#39;induction du diabète par STZ (5,1) et la prestation efficace des îlots à la poche capsulaire (5.3.14-5.3.16). STZ est un analogue du glucose d&#39;origine naturelle qui est sélectivement toxique pour les cellules sécrétant de l&#39;insuline des cellules β des îlots-9. Cependant, cette toxicité sélective se produit dans une gamme de concentration relativement étroite. Cela est attesté par le fait que des doses élevées de STZ peut entraîner rapidement (2-3 jours) de létalité en l&#39;absence d&#39;hyperglycémie. Par conséquent, des précautions doivent être prises pour identifier la dose optimale de STZ pour la souche et l&#39;âge des souris étant utilisés avant tout des expériences à grande échelle sont lancées. La livraison physique des îlots à la poche capsulaire est également une étape clé. Pour obtenir des résultats cohérents, il est impératif de minimiser la perte d&#39;îlots lors de leur livraison. Cela peut se produire si il ya des défauts ou des larmes dans la capsule du rein couvrant la poche ou si le volume injecté est trop grand. Dommages à la capsule peut être évité par une manipulation douce et attentive, et en utilisant la sonde en verre lisse pour préparer la poche sous-capsulaire. De plus, le volume d&#39;injection peuvent être minimisés par l&#39;élimination soigneuse du surnageant à l&#39;étape 5.3.6.3. Si le surnageant est éliminé, jusqu&#39;au niveau des îlots sédimenté, il est généralement plus assez de place dans la poche capsulaire au lieu de 400 à 500 îlots. Toutefois, si le volume d&#39;injection est trop importante, les îlots sont plus susceptibles de s&#39;échapper de la poche durant le processus de transplantation, compromettre la reproductibilité de l&#39;expérience. Dans ce protocole, il est possible de modifier certaines des étapes et toujours obtenir des résultats satisfaisants. Ces sont les suivants: (a) l&#39;utilisation d&#39;une enzyme différente pour digérer le pancréas, (b) une méthode différente pour la prestation de l&#39;enzyme du pancréas, (c) l&#39;utilisation d&#39;un processus continu de Ficoll-sodium-diatrizoate (DSE) gradient au lieu de la densité Histopaque1077 seule étape, et (d) la transplantation d&#39;îlots à des endroits autres que le subcapsule reins. <ol class="lalpha"><li> Dans ce protocole, Libérase est utilisée pour affaiblir les contacts cellule-cellule au sein du pancréas. Libérase est essentiellement un mélange de très purifiée collagénases qui se sont avérés utiles dans la libération des îlots du pancréas. Toutefois, moins purifié collagénases sont capables d&#39;accomplir un résultat similaire. Par conséquent, il est possible d&#39;utiliser différentes préparations enzymatiques disponibles commercialement pour digérer le pancréas, tant que la condition de digestion est optimisé pour obtenir une qualité élevée des îlots, le rendement et la pureté. </li><li> Il est également possible de digérer le pancréas sans perfusion d&#39;enzyme canalaire. La livraison des Libérase travers le canal cholédoque permet une exposition maximale de la surface du pancréas à l&#39;enzyme. Il en résulte une digestion plus du pancréas et une plus grande libération de îlots intacts. Toutefois, d&#39;autres mesures pour augmenter la surface du pancréas à l&#39;enzyme peut être utilisée. Par exemple, hacher le pancréas avant incubation dans Libérase ou directement injecter Libérase à travers la capsule du pancréas peut être utilisé pour isoler les îlots. Cependant, aucun autre mode de livraison Libérase est aussi efficace que la perfusion à travers le canal cholédoque. Par conséquent, l&#39;injection directe hachage ou devrait être réservée en dernier recours, si le cholédoque est endommagé et ne pas perfusable. </li><li> Une méthode alternative pour séparer les îlots à partir des cellules exocrines implique lal&#39;utilisation d&#39;un gradient de DSE au lieu d&#39;Histopaque1077 10. La séparation efficace des îlots de cellules exocrines dans ce protocole est en partie due à un différentiel de densité entre les deux types cellulaires. Histopaque1077 a une densité de 1,0771 g / ml à 25 ° C. A cette température, Histopaque est plus dense que les îlots, mais moins dense que les cellules exocrines. Par conséquent, sous la force de centrifugation, Histopaque1077 granules des cellules exocrines tout en soulevant les îlots à la surface. En principe, toute autre substance avec une densité qui peut séparer les îlots de cellules exocrines peuvent être utilisés dans cette étape et le gradient de DSE est l&#39;une de ces substances. </li><li> En ce qui concerne l&#39;emplacement des îlots de transplantation, la capsule du rein utilisé dans ce protocole est l&#39;un des rares sites possibles. Alors que le subcapsule rein est le site le plus fréquemment rapportés de la transplantation chez les souris, les sites de la transplantation d&#39;autres ont été trouvés pour être efficaces et qu&#39;ils comprennent la veine porte, l&#39;espace sous-rétinien, les testicules, l&#39;épididyme coussinet adipeux, la rate, du pancréas et même 11-14. Chacun de ces lieux a ses propres avantages et les défis. Par conséquent, la sélection d&#39;un site pour la transplantation d&#39;îlots doit être déterminée par les questions abordées et des circonstances particulières de l&#39;expérimentation. </li></ol> On croit que les stratégies qui peuvent dépasser les limites sur la transplantation d&#39;îlots va considérablement accroître son potentiel thérapeutique. Par conséquent, l&#39;utilisation d&#39;un modèle murin tel que détaillé par ce protocole offre une approche intéressante pour identifier de telles stratégies.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>31800-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liberase TL</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>05401020001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque1077</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Citrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S4641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptozotocin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S-0130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A144-212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vedco</td>
<td>ISOSOL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary Tubes</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22362574</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin Syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>329461</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>27 Gauge Syringe Needle</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>305109</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton Syringe #1702</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>14813133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10cm Petri Plates</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0875712</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6cm Petri Plates</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>07770212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-0 Suture</td>
<td>Equipment</td>
<td>Ethicon</td>
<td>8726H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE 50 Flexible Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>NC9083963</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5ml Disposable Syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>309603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50ml Conical Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15ml Conical Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1mm Nylon Mesh</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22363549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.419mm Wire Mesh</td>
<td>Equipment</td>
<td>Newark Wire Cloth Company</td>
<td>0300241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bath Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-462-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Microscope</td>
<td>Equipment</td>
<td>Zeiss</td>
<td>Stemi SV6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>Equipment</td>
<td>Nikon</td>
<td>TMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Napco</td>
<td>6300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS14393</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>McPherson-Vannas Scissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS15915</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemostatic Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS 500451</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane Nebulizer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Smiths Medical Surgivet</td>
<td>ISOTech 4 OHMEDA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Swing Bucket Centrifuge</td>
<td>Equipment</td>
<td>Dupont &#x2013; Sorvall</td>
<td>RT6000D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Swing Bucket Rotor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Dupont &#x2013; Sorvall</td>
<td>H1000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH Meter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Mettler Toledo/ Fisher Scientific</td>
<td>09313509</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel Loading Tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05408151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>p200 Tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>111-0730</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation

Depuis les premiers travaux de pionnier de Ballinger et Reckard démontrant que la transplantation d&#39;îlots de Langerhans dans les rongeurs diabétiques pourraient normaliser leurs taux de glycémie, la transplantation d&#39;îlots a été proposé pour être un traitement potentiel pour 1,2 diabète de type 1. Plus récemment, les progrès de la transplantation d&#39;îlots humains ont encore renforcé ce point de vue 1,3. Cependant, deux limitations majeures empêchent la transplantation d&#39;îlots d&#39;être une réalité largement répandue cliniques: (a) l&#39;obligation pour un grand nombre d&#39;îlots par patient, ce qui réduit considérablement le nombre de bénéficiaires potentiels, et (b) la nécessité d&#39;une immunosuppression lourde, qui affecte de manière significative la population pédiatrique de patients en raison de leur vulnérabilité à long terme immunosuppression. Les stratégies qui peuvent contourner ces limitations ont le potentiel d&#39;améliorer l&#39;utilité thérapeutique de la transplantation d&#39;îlots. La transplantation d&#39;îlots sous la capsule rénale de souris est un modèle largement accepté pour étudier les différentes stratégies pour améliorer la transplantation d&#39;îlots. Cette expérience nécessite l&#39;isolement des îlots de haute qualité et l&#39;implantation d&#39;îlots pour les bénéficiaires diabétiques. Ces deux procédures nécessitent des étapes chirurgicales qui peuvent être mieux démontré par la vidéo que par texte. Ici, nous documentons les étapes détaillées de ces procédures à la fois par la vidéo et de protocole écrit. Nous discuterons aussi brièvement les modèles de transplantation différents: syngéniques, allogéniques, syngéniques auto-immunes, et allogéniques auto-immunes.

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

La transplantation d&#39;îlots isolés a été proposé pour être un traitement potentiel pour les diabétiques de type 1. Nous décrivons ici une méthode pour isoler les îlots de souris pancréas et de les transplanter à l&#39;espace sous-capsulaire du rein.

Une méthode pour isoler l&#39;îlot murin et transplantation rénale sous-capsulaires

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

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