Name: a method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation at JoVE.com

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	<li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+as+a+treatment+for+diabetes.">Islet transplantation as a treatment for diabetes.</a> J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).</li><li>Gangemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+for+brittle+type+1+diabetes:+the+UIC+protocol.">Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol.</a> Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).</li><li>Zmuda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+ATF3,+an+adaptive-response+gene,+protects+islets+and+ameliorates+inflammation+in+a+syngenic+transplantation+model.">Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model.</a> Diabetologia. , (2010).</li><li>Bottino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Human+Islets+to+Isolation+Stress+and+the+Effect+of+Antioxidant+Treatment.">Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment.</a> Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).</li><li>Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+islet+cell+culture+in+vitro+at+24+degrees+C+on+graft+survival+and+MHC+antigen+expression.">The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression.</a> Transplantation. 49, 272-277 (1990).</li><li>Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cyclosporin-A,+low-temperature+culture,+and+anti-Ia+antibodies+on+prevention+of+rejection+of+rat+islet+allografts.">The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts.</a> Diabetes. 35, 83-88 (1986).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival.">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li><li>Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STZ+transport+and+cytotoxicity.+Specific+enhancement+in+GLUT2-expressing+cells.">STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells.</a> Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).</li><li>Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+in+osmolality+and+range+of+density+of+a+continuous+ficoll-sodium-diatrizoate+gradient+for+isopycnic+purification+of+isolated+human+islets.">Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets.</a> Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).</li><li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts.">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li><li>Nasr, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+Immune+Privilege+Promotes+Transplantation+Tolerance+by+Altering+the+Balance+between+Memory+and+Regulatory+T+Cells.">Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells.</a> J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).</li><li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation.">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).</li><li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats.">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li></ol>

In den vorangegangenen Abschnitten haben wir beschrieben, detaillierte Schritte zur Isolierung und Transplantation der Maus Pankreasinseln. Hier haben wir kurz auf die Schritte, die entscheidend für den Erfolg der Verfahren sind. 1. Islet Isolation Die entscheidenden Schritte sind die Identifizierung eine optimale enzymatische Verdauung der Zeit (1,4), die Positionierung der hemostat Klammer über den Zwölffingerdarm Eröffnung des Choledochus (2.2.3), cannulating den gemeinsamen Gallengang (2,3), kräftiges Schütteln der Bauchspeicheldrüse nach der 37 ° C verdauen (3,2) und für die Beseitigung der exokrinen Zellen Verunreinigungen (3.3.7 und 3.3.16). Diese Schritte haben einen dramatischen Einfluss auf die Qualität, Ausbeute und Reinheit von Inselchen. Vielleicht ist der technisch anspruchsvollsten Schritt ist die Kanülierung des Choledochus. In vielen Mäusen kann der Choledochus nur schwer zu visualisieren aufgrund umgebenden Faszien. Daher ist es üblich, dass Versuche, die Choledochus Ergebnis der Penetration der Faszie Gewebe nur kanülieren. In diesen Fällen beginnt die Liberase auf das umgebende Bindegewebe zu füllen und nicht perfuse der Bauchspeicheldrüse. Wenn dies eingehalten wird, stoppen den Fluss der Liberase und positionieren Sie die Nadel so, dass es dringt in das Lumen des Gallengangs. Mit etwas Übung ist es möglich, schnell die optimale Position für Nadel-Platzierung und die Kanülierung ohne Beschädigung der brüchigen Kanal abgeschlossen. 2. Inseltransplantation Die entscheidenden Schritte sind die STZ Induktion von Diabetes (5,1) und die effiziente Bereitstellung von kleinen Inseln, die subkapsulären Beutel (5.3.14-5.3.16). STZ ist ein natürlich vorkommendes Glucose-Analogon, das selektiv toxisch auf die Insulin-sezernierenden Zellen β-Zellen der Inseln 9 ist. Allerdings tritt diese selektive Toxizität in einem relativ engen Konzentrationsbereich. Dies wird durch die Tatsache, dass hohe Dosen von STZ kann in schnellen (2-3 Tage) Letalität in der Abwesenheit von Hyperglykämie Ergebnis belegt. Daher sollte darauf geachtet werden, um die optimale Dosis von STZ für den Stamm und Alter der Mäuse sein, bevor eine breit angelegte Erprobung eingeleitet zu identifizieren sein. Die physische Lieferung der Inseln, die subkapsulären Beutel ist auch ein wichtiger Schritt. Um dies zu erreichen konsistente Ergebnisse, ist es unerlässlich, den Verlust der Inseln während der Auslieferung zu minimieren. Dies kann auftreten, wenn Mängel oder Tränen in die Nierenkapsel für die Tasche sind oder wenn das injizierte Volumen ist zu groß. Eine Beschädigung der Kapsel kann durch sanfte und schonende Manipulation und mit glatten Glas-Sonde, die subkapsulären Beutel Vorbereitung vermieden werden. Darüber hinaus kann das Injektionsvolumen mit sorgfältiger Entfernung des Überstands in Schritt 5.3.6.3 minimiert werden. Wenn der Überstand bis auf die Ebene des sedimentierten Inseln entfernt, gibt es in der Regel mehr als genug Platz in der subkapsulären Beutel zu 400 bis 500 Inseln statt. Allerdings, wenn das Injektionsvolumen zu groß ist, sind die Inseln eher Leck aus dem Beutel während der Transplantation, dabei die Reproduzierbarkeit des Experiments. In diesem Protokoll ist es möglich, einige der Schritte verändern und immer noch zufriedenstellende Ergebnisse. Dazu gehören die folgenden: (a) die Verwendung eines anderen Enzyms der Bauchspeicheldrüse verdauen, (b) eine andere Methode für die Bereitstellung des Enzyms an der Bauchspeicheldrüse, (c) die Verwendung eines kontinuierlichen Ficoll-Natrium-Diatrizoat (FSD) Gradienten anstelle des einzigen Dichte Histopaque1077 Schritt, und (d) Inseltransplantation zu anderen Orten als der Niere subcapsule. <ol class="lalpha"><li> In diesem Protokoll wird Liberase verwendet, um die Zell-Zell-Kontakte in der Bauchspeicheldrüse zu schwächen. Liberase ist im Wesentlichen ein Gemisch aus hochreinem Kollagenasen, die sich bewährt haben, bei der Freisetzung von Inseln aus der Bauchspeicheldrüse. Allerdings sind weniger gereinigt Kollagenasen zu leisten imstande ein ähnliches Ergebnis. Daher ist es möglich, verschiedene kommerziell erhältliche Enzympräparate für die Verdauung der Bauchspeicheldrüse zu verwenden, solange die Verdauung optimal eingestellt ist, um hohe Qualität zu erreichen Insel, Ausbeute und Reinheit. </li><li> Es ist auch möglich, die Bauchspeicheldrüse ohne duktale Perfusion des Enzyms zu verdauen. Lieferung von Liberase durch den Choledochus ermöglicht maximale Exposition von Pankreas-Fläche an das Enzym. Dies führt zu mehr auch die Verdauung der Bauchspeicheldrüse und eine größere Freisetzung von intakten Inseln. Jedoch können auch andere Schritte, um die Oberfläche der Bauchspeicheldrüse an das Enzym zu erhöhen verwendet werden. Zum Beispiel kann Zerkleinern der Bauchspeicheldrüse vor Inkubation in Liberase oder direkt injiziert Liberase durch die Pankreas-Kapsel verwendet, um Inseln zu isolieren. Allerdings ist kein anderes Verfahren zur Liberase Lieferung so effektiv wie Perfusion durch den gemeinsamen Gallengang. Daher sollten Zerkleinern oder Direkteinspritzung als letztes Mittel reserviert werden, wenn der Choledochus ist beschädigt und nicht perfundierbaren. </li><li> Eine alternative Methode zur Trennung von den Inseln aus dem exokrinen Zellen umfasst dieVerwendung eines FSD Farbverlauf statt Histopaque1077 10. Die effiziente Trennung von Inseln aus exokrinen Zellen in diesem Protokoll ist zum Teil auf eine Dichte Differenz zwischen den beiden Zelltypen. Histopaque1077 hat eine Dichte von 1,0771 g / ml bei 25 ° C. Bei dieser Temperatur ist Histopaque dichter als die Inseln, aber weniger dicht als die exokrinen Zellen. Daher unter der Kraft der Zentrifugation Histopaque1077 Pellets der exokrinen Zellen beim Anheben der Inseln an der Oberfläche. Im Prinzip kann jede andere Substanz mit einer Dichte, dass Inseln von exokrinen Zellen trennen kann in diesem Schritt verwendet werden und die FSD Gradient ist ein solcher Stoff. </li><li> In Bezug auf die Lage für kleine Inseln Transplantation wird die Nierenkapsel in diesem Protokoll verwendet eine der wenigen möglichen Standorten. Während der Niere subcapsule ist die am häufigsten berichteten Ort der Transplantation in Mäuse, haben andere Transplantation Standorten als wirksam erwiesen, und sie gehören der Pfortader, subretinalen Raum, Hoden, Nebenhoden Fettpolster, Milz, Bauchspeicheldrüse und sogar 11-14. Jeder dieser Orte hat seine eigenen Vorteile und Herausforderungen. Daher sollte die Auswahl eines Standortes für Inseltransplantation durch die Fragen angesprochen und spezifischen Gegebenheiten der Experimente bestimmt werden. </li></ol> Es wird angenommen, dass die Strategien, die die Grenzen auf Inseltransplantation überwinden können, werden drastisch verbessern sein therapeutisches Potential. Daher bietet der Einsatz von einem Mausmodell so detailliert durch dieses Protokoll einen attraktiven Ansatz zur Identifizierung solcher Strategien.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>31800-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liberase TL</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>05401020001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque1077</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Citrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S4641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptozotocin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S-0130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A144-212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vedco</td>
<td>ISOSOL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary Tubes</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22362574</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin Syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>329461</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>27 Gauge Syringe Needle</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>305109</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton Syringe #1702</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>14813133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10cm Petri Plates</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0875712</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6cm Petri Plates</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>07770212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-0 Suture</td>
<td>Equipment</td>
<td>Ethicon</td>
<td>8726H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE 50 Flexible Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>NC9083963</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5ml Disposable Syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>309603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50ml Conical Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15ml Conical Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1mm Nylon Mesh</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22363549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.419mm Wire Mesh</td>
<td>Equipment</td>
<td>Newark Wire Cloth Company</td>
<td>0300241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bath Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-462-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Microscope</td>
<td>Equipment</td>
<td>Zeiss</td>
<td>Stemi SV6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>Equipment</td>
<td>Nikon</td>
<td>TMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Napco</td>
<td>6300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS14393</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>McPherson-Vannas Scissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS15915</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemostatic Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS 500451</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane Nebulizer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Smiths Medical Surgivet</td>
<td>ISOTech 4 OHMEDA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Swing Bucket Centrifuge</td>
<td>Equipment</td>
<td>Dupont &#x2013; Sorvall</td>
<td>RT6000D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Swing Bucket Rotor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Dupont &#x2013; Sorvall</td>
<td>H1000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH Meter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Mettler Toledo/ Fisher Scientific</td>
<td>09313509</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel Loading Tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05408151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>p200 Tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>111-0730</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation

Seit den frühen Pionierarbeiten von Ballinger und Reckard zeigen, dass die Transplantation von Langerhans-Inseln in diabetischen Nagern ihren Blutzuckerspiegel zu normalisieren könnte, hat Inseltransplantation vorgeschlagen worden, eine mögliche Behandlung für Diabetes Typ 1 1,2 sein. In jüngerer Zeit haben Fortschritte in der menschlichen Inseltransplantation weitere dieser Ansicht 1,3 gestärkt. Allerdings verhindern, dass zwei wesentliche Einschränkungen Inseltransplantation von einem breiten klinischen Realität: (a) die Voraussetzung für eine große Anzahl von Inseln pro Patient, die eine erhebliche Verringerung der Zahl der potenziellen Empfänger und (b) die Notwendigkeit für schwere Immunsuppression, die erheblich beeinträchtigt der pädiatrischen Population von Patienten aufgrund ihrer Anfälligkeit für langfristige Immunsuppression. Strategien, die diese Einschränkungen zu überwinden haben das Potenzial, den therapeutischen Nutzen von Inseltransplantation verbessern. Inseltransplantation unter der Maus Nierenkapsel ist ein weithin akzeptiertes Modell, um verschiedene Strategien zu untersuchen, um Inseltransplantation verbessern. Dieses Experiment erfordert die Isolierung von hoher Qualität Inselchen und Implantation von kleinen Inseln, die diabetische Empfänger. Beide Verfahren erfordern chirurgische Schritte, die besser durch Video werden als durch Text nachgewiesen. Hier dokumentieren wir die einzelnen Schritte für diese Verfahren durch Video-und schriftlichen Protokoll. Wir haben auch kurz auf verschiedene Modelle Transplantation: syngenen, allogenen, syngenen autoimmune und allogenen autoimmune.

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Die Transplantation von isolierten Inseln wurde vorgeschlagen, eine potenzielle Behandlungsoption für Typ-1-Diabetes sein. Hier beschreiben wir eine Methode, um kleine Inseln aus Maus Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und verpflanzen sie in die subkapsulären Raum der Niere.

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

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