Name: a method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation at JoVE.com

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<ol>
	<li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+as+a+treatment+for+diabetes.">Islet transplantation as a treatment for diabetes.</a> J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).</li><li>Gangemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+for+brittle+type+1+diabetes:+the+UIC+protocol.">Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol.</a> Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).</li><li>Zmuda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+ATF3,+an+adaptive-response+gene,+protects+islets+and+ameliorates+inflammation+in+a+syngenic+transplantation+model.">Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model.</a> Diabetologia. , (2010).</li><li>Bottino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Human+Islets+to+Isolation+Stress+and+the+Effect+of+Antioxidant+Treatment.">Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment.</a> Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).</li><li>Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+islet+cell+culture+in+vitro+at+24+degrees+C+on+graft+survival+and+MHC+antigen+expression.">The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression.</a> Transplantation. 49, 272-277 (1990).</li><li>Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cyclosporin-A,+low-temperature+culture,+and+anti-Ia+antibodies+on+prevention+of+rejection+of+rat+islet+allografts.">The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts.</a> Diabetes. 35, 83-88 (1986).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival.">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li><li>Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STZ+transport+and+cytotoxicity.+Specific+enhancement+in+GLUT2-expressing+cells.">STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells.</a> Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).</li><li>Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+in+osmolality+and+range+of+density+of+a+continuous+ficoll-sodium-diatrizoate+gradient+for+isopycnic+purification+of+isolated+human+islets.">Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets.</a> Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).</li><li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts.">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li><li>Nasr, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+Immune+Privilege+Promotes+Transplantation+Tolerance+by+Altering+the+Balance+between+Memory+and+Regulatory+T+Cells.">Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells.</a> J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).</li><li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation.">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).</li><li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats.">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nelle sezioni di cui sopra, abbiamo descritto la procedura dettagliata per l&#39;isolamento e trapianto delle isole pancreatiche del mouse. Qui, brevemente evidenziare i passaggi che sono critico per il successo delle procedure. 1. Isolotto isolamento I passi principali sono identificare un momento ottimale digestione enzimatica (1,4), il posizionamento della pinza emostatica sopra l&#39;apertura duodenale del dotto biliare comune (2.2.3), cannulating il dotto biliare comune (2,3), agitazione vigorosa del pancreas dopo i 37 ° C digerire (3,2), e la rimozione di contaminazione delle cellule esocrine (3.3.7 e 3.3.16). Questi passaggi hanno un influsso drammatico sulla qualità della resa, e la purezza di isolotti. Forse il punto tecnicamente più impegnativo è l&#39;incannulazione del dotto biliare comune. In molti topi, il dotto biliare comune possono essere difficili da visualizzare a causa della fascia circostante. Pertanto, è comune che i tentativi di cannulate il dotto biliare comune risultato in termini di penetrazione del tessuto fascia unica. In questi casi, il Liberase comincia a riempire il tessuto connettivo circostante e non profumato al pancreas. Se questa è osservato, fermare il flusso di Liberase e riposizionare l&#39;ago in modo che penetri nel lume del dotto biliare. Con la pratica, è possibile identificare velocemente la posizione ottimale per il posizionamento dell&#39;ago e per completare la cannulazione senza danneggiare il condotto friabile. 2. Trapianto di isole I passi fondamentali sono l&#39;induzione STZ di diabete (5,1) e la consegna efficiente delle isole nella busta subcapsulare (5.3.14-5.3.16). STZ è un analogo del glucosio naturale che è selettivamente tossica per le cellule che secernono l&#39;insulina β-cellule delle isole 9. Tuttavia, questa tossicità selettiva avviene in un intervallo di concentrazione relativamente ristretti. Ciò è dimostrato dal fatto che alte dosi di STZ può provocare un rapido (2-3 giorni) letalità in assenza di iperglicemia. Pertanto, occorre prestare attenzione per identificare la dose ottimale di STZ per il ceppo di topi e l&#39;età in uso prima di ogni esperimento su larga scala sono iniziati. La consegna fisica delle isole nella busta sottocapsulare è anche un passo fondamentale. Per ottenere risultati costanti, è indispensabile ridurre al minimo la perdita di isolotti nel corso della loro consegna. Ciò può verificarsi se ci sono difetti o rotture della capsula del rene che copre il sacchetto o se il volume iniettato è troppo grande. Danni alla capsula può essere evitato con la manipolazione dolce e attenta, e utilizzando la sonda vetro liscio per preparare il sacchetto sottocapsulare. Inoltre, il volume di iniezione può essere minimizzato con rimozione accurata del surnatante al punto 5.3.6.3. Se il surnatante viene rimosso fino al livello degli isolotti sedimentate, non vi è in genere più di spazio sufficiente nel sacchetto subcapsulari al posto 400-500 isolotti. Tuttavia, se il volume di iniezione è troppo grande, gli isolotti hanno maggiori probabilità di fuoriuscire il sacchetto durante il processo di trapianto, compromettendo la riproducibilità dell&#39;esperimento. All&#39;interno di questo protocollo, è possibile modificare alcuni dei passaggi e ottenere comunque risultati soddisfacenti. Questi includono: (a) l&#39;utilizzo di un enzima diverso per digerire il pancreas, (b) un metodo diverso per la consegna l&#39;enzima al pancreas, (c) l&#39;uso di un continuo Ficoll-sodio-diatrizoato (FSD) gradiente al posto del singolo densità Histopaque1077 passo, e (d) trapianto di isole pancreatiche in luoghi diversi dal subcapsule rene. <ol class="lalpha"><li> In questo protocollo, Liberase è usato per indebolire la cellula-cellula contatti all&#39;interno del pancreas. Liberase è essenzialmente una miscela altamente purificato di collagenasi che si sono dimostrati utili nel liberare isole dal pancreas. Tuttavia, collagenasi meno purificati sono in grado di realizzare un risultato simile. Pertanto, è possibile utilizzare diversi preparati enzimatici disponibili in commercio per digerire il pancreas, fino a quando la condizione di digestione è ottimizzato per ottenere una qualità elevata delle isole, la resa e la purezza. </li><li> E &#39;anche possibile per digerire il pancreas senza perfusione duttale di enzima. Consegna del Liberase attraverso il dotto biliare comune permette di esposizione massima di zona del pancreas superficie per l&#39;enzima. Ciò si traduce in più anche la digestione del pancreas e una maggiore rilascio di isolette intatte. Tuttavia, altre misure per aumentare la superficie del pancreas per l&#39;enzima può essere utilizzato. Per esempio, macinazione del pancreas prima incubazione in Liberase o direttamente iniettando Liberase attraverso la capsula pancreatica può essere utilizzato per isolare isolotti. Tuttavia, nessun altro metodo di consegna Liberase è efficace come perfusione attraverso il dotto biliare comune. Pertanto, macinazione o iniezione diretta dovrebbe essere riservato come ultima risorsa, se il dotto biliare comune è danneggiato e non perfusable. </li><li> Un metodo alternativo per separare gli isolotti dalle cellule esocrine comporta lal&#39;uso di un gradiente FSD Histopaque1077 invece di 10. La separazione efficiente di isolotti dalle cellule esocrine in questo protocollo è in parte dovuto ad una differenza di densità tra i due tipi di cellule. Histopaque1077 ha una densità di 1,0771 g / ml a 25 ° C. A questa temperatura, HISTOPAQUE è più densa gli isolotti, ma meno densa rispetto alle cellule esocrine. Pertanto, sotto la forza di centrifugazione, Histopaque1077 pellet le cellule esocrine mentre si solleva il isolotti in superficie. In linea di principio, qualsiasi altra sostanza con una densità che che può separare isolotti dalle cellule esocrine possono essere utilizzati in questo passaggio e il gradiente FSD è una sostanza del genere. </li><li> Per quanto riguarda la posizione per il trapianto di isole, la capsula del rene usati in questo protocollo è uno dei pochi siti possibili. Mentre il subcapsule rene è il luogo più comunemente riportati di trapianto nei topi, il trapianto di altri siti sono stati trovati per essere efficace e comprendono la vena porta epatica, spazio sottoretinico, del testicolo, dell&#39;epididimo cuscinetto adiposo, milza e pancreas anche 11-14. Ognuno di questi luoghi, ha i propri vantaggi e le sfide. Pertanto, la scelta di un sito per il trapianto di isole deve essere determinato dal questioni affrontate e le circostanze specifiche degli esperimenti. </li></ol> Si ritiene che le strategie che possono superare i limiti sul trapianto di isole drasticamente aumentare il suo potenziale terapeutico. Pertanto, l&#39;uso di un modello murino come descritto da questo protocollo offre un approccio interessante per identificare tali strategie.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>31800-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liberase TL</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>05401020001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque1077</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Citrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S4641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptozotocin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S-0130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A144-212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vedco</td>
<td>ISOSOL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary Tubes</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22362574</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin Syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>329461</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>27 Gauge Syringe Needle</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>305109</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton Syringe #1702</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>14813133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10cm Petri Plates</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0875712</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6cm Petri Plates</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>07770212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-0 Suture</td>
<td>Equipment</td>
<td>Ethicon</td>
<td>8726H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE 50 Flexible Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>NC9083963</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5ml Disposable Syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>309603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50ml Conical Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15ml Conical Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1mm Nylon Mesh</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22363549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.419mm Wire Mesh</td>
<td>Equipment</td>
<td>Newark Wire Cloth Company</td>
<td>0300241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bath Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-462-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Microscope</td>
<td>Equipment</td>
<td>Zeiss</td>
<td>Stemi SV6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>Equipment</td>
<td>Nikon</td>
<td>TMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Napco</td>
<td>6300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS14393</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>McPherson-Vannas Scissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS15915</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemostatic Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS 500451</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane Nebulizer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Smiths Medical Surgivet</td>
<td>ISOTech 4 OHMEDA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Swing Bucket Centrifuge</td>
<td>Equipment</td>
<td>Dupont &#x2013; Sorvall</td>
<td>RT6000D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Swing Bucket Rotor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Dupont &#x2013; Sorvall</td>
<td>H1000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH Meter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Mettler Toledo/ Fisher Scientific</td>
<td>09313509</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel Loading Tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05408151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>p200 Tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>111-0730</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation

Dal momento che i primi lavori pionieristici di Ballinger e Reckard dimostrando che il trapianto di isole di Langerhans in roditori diabetici potrebbe normalizzare i loro livelli di glucosio nel sangue, il trapianto di isole è stato proposto di essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1 1,2. Più recentemente, i progressi nella trapianto di isole umane hanno ulteriormente rafforzato questa visione 1,3. Tuttavia, due limitazioni principali impediscono il trapianto di isole ad essere una realtà diffusa clinico: (a) la necessità di un gran numero di isolotti per paziente, che riduce fortemente il numero dei potenziali destinatari, e (b) la necessità di immunosoppressione pesante, che colpisce in modo significativo la popolazione pediatrica di pazienti a causa della loro vulnerabilità a lungo termine immunosoppressione. Strategie che possono superare questi limiti hanno la potenzialità di migliorare l&#39;utilità terapeutica del trapianto di isole. Trapianto di isole sotto la capsula renale mouse è un modello ampiamente accettato di studiare strategie diverse per migliorare il trapianto di isole. Questo esperimento richiede l&#39;isolamento delle isole di alta qualità e l&#39;impianto di isolotti ai destinatari diabetica. Entrambe le procedure richiedono operazioni chirurgiche che possono essere meglio dimostrato dal video che per il testo. Qui, documentano la procedura dettagliata per queste procedure sia da video e protocollo scritto. Abbiamo anche brevemente il trapianto di modelli diversi: singenico, allogenico, autoimmuni singenici, e allogenico autoimmuni.

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Trapianto di isole isolate è stato proposto di essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1. Qui si descrive un metodo per isolare le isole dal pancreas del mouse e trapiantarle allo spazio sottocapsulare del rene.

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Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

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