Name: a method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00
Duration: 17 min 42 s
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<ol>
	<li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+as+a+treatment+for+diabetes.">Islet transplantation as a treatment for diabetes.</a> J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).</li><li>Gangemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+for+brittle+type+1+diabetes:+the+UIC+protocol.">Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol.</a> Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).</li><li>Zmuda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+ATF3,+an+adaptive-response+gene,+protects+islets+and+ameliorates+inflammation+in+a+syngenic+transplantation+model.">Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model.</a> Diabetologia. , (2010).</li><li>Bottino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Human+Islets+to+Isolation+Stress+and+the+Effect+of+Antioxidant+Treatment.">Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment.</a> Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).</li><li>Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+islet+cell+culture+in+vitro+at+24+degrees+C+on+graft+survival+and+MHC+antigen+expression.">The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression.</a> Transplantation. 49, 272-277 (1990).</li><li>Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cyclosporin-A,+low-temperature+culture,+and+anti-Ia+antibodies+on+prevention+of+rejection+of+rat+islet+allografts.">The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts.</a> Diabetes. 35, 83-88 (1986).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival.">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li><li>Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STZ+transport+and+cytotoxicity.+Specific+enhancement+in+GLUT2-expressing+cells.">STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells.</a> Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).</li><li>Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+in+osmolality+and+range+of+density+of+a+continuous+ficoll-sodium-diatrizoate+gradient+for+isopycnic+purification+of+isolated+human+islets.">Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets.</a> Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).</li><li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts.">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li><li>Nasr, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+Immune+Privilege+Promotes+Transplantation+Tolerance+by+Altering+the+Balance+between+Memory+and+Regulatory+T+Cells.">Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells.</a> J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).</li><li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation.">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).</li><li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats.">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

上記のセクションでは、我々はマウスの膵島を分離して移植するための詳細な手順を説明した。ここで、我々は、簡単に手続きの成功にとって重要なステップを強調表示します。 1。膵島の分離重要なステップは37の後に総胆管（2.3）、膵臓の激しい振動をcannulating、総胆管（2.2.3）の十二指腸開口部に止血クランプを配置、最適な酵素消化の時間（1.4）を識別している° Cダイジェスト（3.2）、および外分泌細胞の汚染の除去（3.3.7と3.3.16）。これらの手順は、膵島の品質、収量や純度に劇的な影響を与える。おそらく、最も技術的に困難なステップは、総胆管のカニューレです。多くのマウスでは、総胆管は、周囲の筋膜による可視化が困難になる可能性があります。したがって、試行が唯一の筋膜組織の浸透の総胆管の結果をカニューレを挿入するためにするのが一般的である。これらのインスタンスでは、リベラーゼは周囲の結合組織を埋めるために開始され、膵臓を灌流していません。これが認められる場合は、リベラーゼの流れを停止し、それが胆管の内腔に浸透するように針の位置を変更。練習すれば、それはすぐに針を配置するための最適な位置を特定し、砕けやすいのダクトに損傷を与えることなく、カニュレーションを完了することが可能です。 2。膵島移植重要なステップは、糖尿病（5.1）のSTZ誘導及び被膜下のポーチ（5.3.14-5.3.16）に膵島の効率的な配信です。 STZは、インスリン分泌細胞膵島9のβ-細胞に選択的に毒性が、天然に存在するグルコースのアナログです。しかし、この選択毒性は比較的狭い濃度範囲で発生します。これは、STZの高用量は、高血糖の存在下で急速な（2-3日）致死性をもたらすことができるという事実によって証明されています。したがって、任意の大規模な実験が開始される前に使用されているマウスの系統および年齢のためにSTZの最適な用量を識別するために注意すべきである。嚢下ポーチに小島の物理的なデリバリーも重要なステップです。一貫性のある結果を達成するために、それは彼らの配達中に膵島の損失を最小限に抑えることが不可欠です。ポーチをカバーする腎臓被膜の欠陥や涙があるかどうか注入量が大きすぎる場合に発生する可能性があります。カプセルの損傷は、と嚢下袋を準備するために滑らかなガラスのプローブを使用して穏やか、慎重に操作することで回避できます。さらに、注入量は、ステップ5.3.6.3の上清を注意深く除去して最小限に抑えることができます。上清を沈降した膵島のレベルにまで除去されている場合は、通常は400から500膵島を配置する嚢下ポーチ内に十分なスペースよりももっとあります。しかし、注入量が大きすぎると、小島は、実験の再現性を犠牲にすること、移植の過程でポーチから漏れやすくなります。 このプロトコルでは、それは手順の一部を変更しても、満足できる成果を達成することが可能です。これらは、次のとおりです（a）の膵臓を消化するためにさまざまな酵素の使用、膵臓に酵素を提供するため（b）の別の方法、（c）の連続フィコール - ナトリウム - ジアトリゾエート（FSD）のグラデ​​ーションの使用代わりに、単一の密度Histopaque1077ステップ、および腎臓の被膜下以外の場所から（d）膵島移植の。 <ol class="lalpha"><li>このプロトコルでは、リベラーゼは、膵臓内の細胞間接触を弱めるために使用されます。リベラーゼは、本質的に非常に膵臓から膵島を放出に有用な証明されているコラゲナーゼを精製の混合物である。しかし、あまり精製されたコラゲナーゼは、同様の結果を達成することが可能です。したがって、消化の条件は、高膵島品質、収量と純度を達成するために最適化されている限り、膵臓を消化するために別の市販の酵素製剤を使用することが可能です。 </li><li>それは酵素の膵管灌流することなく膵臓を消化することも可能です。総胆管を通じてリベラーゼの配信は、酵素の膵臓の表面積の最大露出することができます。膵臓と無傷の島の大放出のより均一な消化でこの結果。しかし、酵素に膵臓の表面積を増やすために他の手順を使用することができます。例えば、リベラーゼでそれをインキュベートまたは直接膵臓のカプセルを通じてリベラーゼを注入する前に刻む膵臓は、膵島を分離するために使用することができます。しかし、リベラーゼの配信の他の方法では、総胆管を介して灌流と同程度に有効ではありません。したがって、ミンチまたは直接注入は、総胆管が破損しperfusableされていない場合は、最後の手段として確保しておく必要があります。 </li><li>外分泌細胞から膵島を分離するための代替方法が含まれますHistopaque1077 10の代わりにFSDのグラデーションを使用してください。このプロトコルの外分泌細胞からの膵島の効率的な分離は、部分的に2種類の細胞型との間の密度差によるものです。 Histopaque1077は25 1.0771グラム/ mlの密度℃である。この温度で​​は、Histopaqueは外分泌細胞より小さく密度の高い島よりも密度が高いですが。したがって、遠心分離、Histopaque1077ペレット外分泌細胞の力で表面に膵島を持ち上げながら。原則として、外分泌細胞から膵島を分離できることを密度と他の物質は、このステップで使用され、FSD勾配は、そのような物質であることができる。 </li><li>膵島移植のための場所に関しては、このプロトコルで使用される腎臓被膜は、いくつかの候補地の一つです。腎臓の被膜下にマウスの移植の最も一般的に報告のサイトですが、他の移植サイトが有効であることが明らかに、彼らは肝門脈、網膜下腔、精巣、精巣上体脂肪パッド、脾臓、さらに膵臓11-14を含んされています。これらの場所のそれぞれにはそれぞれ利点と課題があります。したがって、膵島移植のためのサイトの選択は、実験の対処の質問および特定の状況によって決定されるべきである。 </li></ol>それは、膵島移植の制限を克服することができる戦略は劇的にその治療の可能性を高めると考えられています。したがって、このプロトコルで詳述するようにマウスモデルを使用すると、そのような戦略を特定するための魅力的なアプローチを提供しています。

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>31800-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liberase TL</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>05401020001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque1077</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Citrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S4641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptozotocin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S-0130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A144-212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vedco</td>
<td>ISOSOL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary Tubes</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22362574</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin Syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>329461</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>27 Gauge Syringe Needle</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>305109</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton Syringe #1702</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>14813133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10cm Petri Plates</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0875712</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6cm Petri Plates</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>07770212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-0 Suture</td>
<td>Equipment</td>
<td>Ethicon</td>
<td>8726H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE 50 Flexible Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>NC9083963</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5ml Disposable Syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>309603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50ml Conical Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15ml Conical Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1mm Nylon Mesh</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22363549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.419mm Wire Mesh</td>
<td>Equipment</td>
<td>Newark Wire Cloth Company</td>
<td>0300241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bath Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-462-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Microscope</td>
<td>Equipment</td>
<td>Zeiss</td>
<td>Stemi SV6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>Equipment</td>
<td>Nikon</td>
<td>TMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Napco</td>
<td>6300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS14393</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>McPherson-Vannas Scissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS15915</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemostatic Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS 500451</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane Nebulizer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Smiths Medical Surgivet</td>
<td>ISOTech 4 OHMEDA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Swing Bucket Centrifuge</td>
<td>Equipment</td>
<td>Dupont &#x2013; Sorvall</td>
<td>RT6000D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Swing Bucket Rotor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Dupont &#x2013; Sorvall</td>
<td>H1000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH Meter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Mettler Toledo/ Fisher Scientific</td>
<td>09313509</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel Loading Tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05408151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>p200 Tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>111-0730</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation

糖尿病のげっ歯類へのランゲルハンス島の移植は、血液中の血糖値を正常化することができることを実証バリンジャーとReckardの初期の先駆的な仕事以来、膵島移植は1型糖尿病の1,2の治療薬であることが提案されている。さらに最近では、人間の膵島移植の進歩は、さらにこのビュー1,3を強化している。しかし、2つの大きな制約は、広範な臨床的現実であることから、膵島移植を防ぐ：著しく影響を及ぼす深刻な潜在的な受信者の数を減らし、患者あたりの小島、多数のための（a）の要件、および重い免疫抑制のための（b）の必要性、長期の免疫抑制への脆弱性に起因する患者の小児集団。これらの制限を克服することができる戦略は、膵島移植の治療的有用性を高める可能性を秘めている。 マウスの腎被膜下膵島移植は膵島移植を向上させるために様々な戦略を調査するために広く受け入れられているモデルです。この実験は、高品質の小島と糖尿病の受信者への膵島移植の分離が必要です。両方の手順は、より良いテキストではなく映像によって示すことができる外科手術手順を実行する必要があります。ここでは、ビデオと書かれたプロトコルの両方でこれらの手順の詳細な手順を文書化します。我々はまた、簡単に別の移植モデルを説明します。同系、同種、同系自己免疫、自己免疫同種。

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

分離された膵島の移植は1型糖尿病の治療薬であることが提案されている。ここでは、マウスの膵臓から膵島を分離し、腎臓の被膜下のスペースにそれらを移植する方法を説明します。

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