Name: a method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00
Duration: 17 min 42 s
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<ol>
	<li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+as+a+treatment+for+diabetes.">Islet transplantation as a treatment for diabetes.</a> J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).</li><li>Gangemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+for+brittle+type+1+diabetes:+the+UIC+protocol.">Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol.</a> Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).</li><li>Zmuda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+ATF3,+an+adaptive-response+gene,+protects+islets+and+ameliorates+inflammation+in+a+syngenic+transplantation+model.">Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model.</a> Diabetologia. , (2010).</li><li>Bottino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Human+Islets+to+Isolation+Stress+and+the+Effect+of+Antioxidant+Treatment.">Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment.</a> Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).</li><li>Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+islet+cell+culture+in+vitro+at+24+degrees+C+on+graft+survival+and+MHC+antigen+expression.">The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression.</a> Transplantation. 49, 272-277 (1990).</li><li>Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cyclosporin-A,+low-temperature+culture,+and+anti-Ia+antibodies+on+prevention+of+rejection+of+rat+islet+allografts.">The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts.</a> Diabetes. 35, 83-88 (1986).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival.">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li><li>Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STZ+transport+and+cytotoxicity.+Specific+enhancement+in+GLUT2-expressing+cells.">STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells.</a> Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).</li><li>Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+in+osmolality+and+range+of+density+of+a+continuous+ficoll-sodium-diatrizoate+gradient+for+isopycnic+purification+of+isolated+human+islets.">Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets.</a> Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).</li><li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts.">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li><li>Nasr, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+Immune+Privilege+Promotes+Transplantation+Tolerance+by+Altering+the+Balance+between+Memory+and+Regulatory+T+Cells.">Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells.</a> J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).</li><li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation.">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).</li><li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats.">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nas seções acima, descrevemos as etapas detalhadas para isolar e transplante de ilhotas pancreáticas mouse. Aqui, nós destacar brevemente os passos que são críticos para o sucesso dos procedimentos. 1. Isolamento de ilhotas Os principais passos são a identificação de um tempo de digestão enzimática ótima (1,4), o posicionamento da pinça hemostática sobre a abertura duodenal do ducto biliar comum (2.2.3), canulação do ducto biliar comum (2,3), agitação vigorosa do pâncreas após as 37 ° C digerir (3.2), e remoção de contaminação das células exócrinas (3.3.7 e 3.3.16). Estes passos têm uma influência dramática sobre o rendimento, qualidade e pureza de ilhotas. Talvez o passo mais tecnicamente desafiador é a canulação do ducto biliar comum. Em muitos ratos, o ducto biliar comum podem ser difíceis de visualizar devido à fáscia circundante. Portanto, é comum que tenta canular o resultado do duto biliar comum na penetração do tecido fascia só. Nestes casos, o Liberase começa a encher o tecido conectivo e não perfundir o pâncreas. Se isso for constatado, interromper o fluxo de Liberase e reposicionar a agulha para que ela penetra no lúmen do ducto biliar. Com a prática, é possível identificar rapidamente a posição ideal para a colocação da agulha e para completar a canulação sem danificar a conduta friáveis. 2. Transplante de ilhotas Os passos críticos são a indução do diabetes STZ (5.1) e uma entrega eficiente de ilhotas para a bolsa subcapsular (5.3.14-5.3.16). STZ é um análogo da glicose que ocorre naturalmente e é seletivamente tóxico para as células secretoras de insulina β-células das ilhotas 9. No entanto, esta toxicidade seletiva ocorre em uma faixa de concentração relativamente estreita. Isto é evidenciado pelo fato de que altas doses de STZ pode resultar em rápida letalidade (2-3 dias), na ausência de hiperglicemia. Portanto, cuidados devem ser tomados para identificar a dose ideal de STZ para a estirpe e idade dos camundongos sendo usadas antes de qualquer experimento de grande escala são iniciadas. A entrega física das ilhotas à bolsa subcapsular também é um passo fundamental. Para alcançar resultados consistentes, é imprescindível para minimizar a perda de ilhotas durante sua entrega. Isto pode ocorrer se houver defeitos ou rasgos na cápsula renal cobrindo a bolsa ou se o volume injetado é muito grande. Danos à cápsula pode ser evitado através de uma manipulação delicada e cuidadosa, e usando sonda de vidro liso para preparar a bolsa subcapsular. Além disso, o volume de injeção pode ser minimizado com a remoção cuidadosa do sobrenadante no passo 5.3.6.3. Se o sobrenadante é removido até o nível das ilhotas sedimentado, normalmente há mais de espaço suficiente na bolsa subcapsular colocar 400-500 ilhotas. No entanto, se o volume de injeção é muito grande, as ilhotas são mais propensos a vazar para fora da bolsa durante o processo de transplante, comprometendo a reprodutibilidade do experimento. Dentro deste protocolo, é possível modificar alguns dos passos e ainda conseguir resultados satisfatórios. Estes incluem o seguinte: (a) o uso de uma enzima diferente para digerir o pâncreas, (b) um método diferente para a entrega da enzima para o pâncreas, (c) o uso de uma contínua Ficoll-diatrizoato de sódio (FSD) gradiente em vez da única etapa densidade Histopaque1077, e (d) transplante de ilhotas para outros locais do que o subcapsule rim. <ol class="lalpha"><li> Neste protocolo, Liberase é usada para enfraquecer os contatos célula-célula dentro do pâncreas. Liberase é essencialmente uma mistura de altamente purificada colagenases que provaram ser úteis na liberação de ilhotas de pâncreas. No entanto, colagenases menos purificados são capazes de realizar um resultado semelhante. Portanto, é possível usar diferentes preparações de enzimas disponíveis comercialmente para a digestão do pâncreas, enquanto a condição de digestão é otimizado para atingir a qualidade de ilhotas de alta, o rendimento e pureza. </li><li> Também é possível para digerir o pâncreas sem perfusão ductal de enzima. Entrega de Liberase através do ducto biliar comum permite a exposição máxima da superfície do pâncreas para a enzima. Isto resulta em mais digestão mesmo do pâncreas e maior liberação de ilhotas intacta. No entanto, outras medidas para aumentar a superfície do pâncreas para a enzima pode ser usado. Por exemplo, o pâncreas do picados antes de incubação em Liberase ou diretamente injetar Liberase através da cápsula de pâncreas pode ser usado para isolar ilhotas. No entanto, nenhum outro método de entrega Liberase é tão eficaz quanto a perfusão através do ducto biliar comum. Portanto, a injeção de picagem ou direta deve ser reservada como último recurso, se o ducto biliar comum está danificado e não perfusable. </li><li> Um método alternativo para a separação das ilhotas de células exócrinas envolve auso de um gradiente de FSD, em vez de Histopaque1077 10. A separação eficiente de ilhotas de células exócrinas neste protocolo é, em parte devido a um diferencial de densidade entre os dois tipos de células. Histopaque1077 tem uma densidade de 1,0771 g / ml a 25 ° C. A esta temperatura, Histopaque é mais denso do que as ilhotas, mas menos densa do que as células exócrinas. Portanto, sob a força da centrifugação, Histopaque1077 pellets as células exócrinas e levantando as ilhotas para a superfície. Em princípio, qualquer outra substância com uma densidade que isso pode separar ilhotas de células exócrinas podem ser usados ​​nesta etapa eo gradiente FSD é uma dessas substâncias. </li><li> Com relação ao local para transplante de ilhotas, a cápsula renal utilizado neste protocolo é um dos poucos sites possível. Enquanto o subcapsule rim é o local mais comumente relatados no transplante em camundongos, sites transplante outros foram encontrados para ser eficaz e que incluem o veia porta hepática, o espaço sub-retiniano, testículos, almofada de gordura epididimal, baço, pâncreas e até 11-14. Cada um desses locais tem suas próprias vantagens e desafios. Portanto, a seleção de um local para transplante de ilhotas devem ser determinados pelas questões abordadas e as circunstâncias específicas dos experimentos. </li></ol> Acredita-se que as estratégias que podem superar as limitações sobre transplante de ilhotas irá aumentar dramaticamente o seu potencial terapêutico. Portanto, o uso de um modelo murino, conforme detalhado por este protocolo oferece uma abordagem atrativa para a identificação de tais estratégias.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>31800-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liberase TL</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>05401020001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque1077</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Citrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S4641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptozotocin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S-0130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A144-212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vedco</td>
<td>ISOSOL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary Tubes</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22362574</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin Syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>329461</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>27 Gauge Syringe Needle</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>305109</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton Syringe #1702</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>14813133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10cm Petri Plates</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0875712</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6cm Petri Plates</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>07770212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-0 Suture</td>
<td>Equipment</td>
<td>Ethicon</td>
<td>8726H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE 50 Flexible Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>NC9083963</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5ml Disposable Syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>309603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50ml Conical Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15ml Conical Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1mm Nylon Mesh</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22363549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.419mm Wire Mesh</td>
<td>Equipment</td>
<td>Newark Wire Cloth Company</td>
<td>0300241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bath Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-462-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Microscope</td>
<td>Equipment</td>
<td>Zeiss</td>
<td>Stemi SV6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>Equipment</td>
<td>Nikon</td>
<td>TMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Napco</td>
<td>6300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS14393</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>McPherson-Vannas Scissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS15915</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemostatic Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS 500451</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane Nebulizer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Smiths Medical Surgivet</td>
<td>ISOTech 4 OHMEDA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Swing Bucket Centrifuge</td>
<td>Equipment</td>
<td>Dupont &#x2013; Sorvall</td>
<td>RT6000D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Swing Bucket Rotor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Dupont &#x2013; Sorvall</td>
<td>H1000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH Meter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Mettler Toledo/ Fisher Scientific</td>
<td>09313509</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel Loading Tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05408151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>p200 Tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>111-0730</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation

Desde os primeiros trabalhos pioneiros de Ballinger e Reckard demonstrando que o transplante de ilhotas de Langerhans em roedores diabéticos poderia normalizar seus níveis de glicose no sangue, transplante de ilhotas tem sido proposta a ser um potencial tratamento para diabetes tipo 1,2 1. Mais recentemente, os avanços no transplante de ilhotas humanas reforçaram ainda mais essa visão 1,3. No entanto, duas grandes limitações evitar transplante de ilhotas de ser uma realidade generalizada clínicos: (a) a exigência de um grande número de ilhotas por paciente, o que reduz severamente o número de potenciais receptores, e (b) a necessidade de imunossupressão pesados, que afeta significativamente a população pediátrica de pacientes devido à sua vulnerabilidade à imunossupressão a longo prazo. Estratégias que possam superar essas limitações têm o potencial de aumentar a utilidade terapêutica do transplante de ilhotas. Transplante de ilhotas sob a cápsula renal do rato é um modelo amplamente aceito para investigar várias estratégias para melhorar transplante de ilhotas. Este experimento requer o isolamento de ilhotas de alta qualidade e implantação de ilhotas para os destinatários diabéticos. Ambos os procedimentos requerem etapas cirúrgicas que podem ser melhor demonstrada por vídeo do que pelo texto. Aqui, nós documentamos os passos detalhados para estes procedimentos por vídeo e protocolo escrito. Nós também discutir brevemente modelos de transplante diferentes: singênico, alogênico, auto-imunes singeneicos e alogênico auto-imunes.

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Transplante de ilhotas isoladas foi proposto para ser um potencial tratamento para diabetes tipo 1. Aqui nós descrevemos um método para isolar ilhotas de rato pancreata e transplantá-las para o espaço subcapsular do rim.

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

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