Name: a method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00
Duration: 17 min 42 s
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<ol>
	<li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+as+a+treatment+for+diabetes.">Islet transplantation as a treatment for diabetes.</a> J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).</li><li>Gangemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+for+brittle+type+1+diabetes:+the+UIC+protocol.">Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol.</a> Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).</li><li>Zmuda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+ATF3,+an+adaptive-response+gene,+protects+islets+and+ameliorates+inflammation+in+a+syngenic+transplantation+model.">Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model.</a> Diabetologia. , (2010).</li><li>Bottino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Human+Islets+to+Isolation+Stress+and+the+Effect+of+Antioxidant+Treatment.">Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment.</a> Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).</li><li>Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+islet+cell+culture+in+vitro+at+24+degrees+C+on+graft+survival+and+MHC+antigen+expression.">The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression.</a> Transplantation. 49, 272-277 (1990).</li><li>Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cyclosporin-A,+low-temperature+culture,+and+anti-Ia+antibodies+on+prevention+of+rejection+of+rat+islet+allografts.">The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts.</a> Diabetes. 35, 83-88 (1986).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival.">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li><li>Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STZ+transport+and+cytotoxicity.+Specific+enhancement+in+GLUT2-expressing+cells.">STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells.</a> Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).</li><li>Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+in+osmolality+and+range+of+density+of+a+continuous+ficoll-sodium-diatrizoate+gradient+for+isopycnic+purification+of+isolated+human+islets.">Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets.</a> Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).</li><li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts.">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li><li>Nasr, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+Immune+Privilege+Promotes+Transplantation+Tolerance+by+Altering+the+Balance+between+Memory+and+Regulatory+T+Cells.">Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells.</a> J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).</li><li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation.">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).</li><li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats.">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li></ol>

En los apartados anteriores, se describen los pasos detallados para el aislamiento y el transplante de los islotes pancreáticos de ratón. En este sentido, destacar brevemente los pasos que son críticos para el éxito de los procedimientos. 1. Aislamiento de islotes Los pasos clave son la identificación de un momento óptimo digestión enzimática (1,4), el posicionamiento de la pinza hemostática sobre la abertura duodenal del conducto biliar común (2.2.3), canulación del conducto biliar común (2,3), una agitación vigorosa del páncreas después de los 37 ° C digerir (3,2), y la eliminación de la contaminación de células exocrinas (3.3.7 y 3.3.16). Estos pasos tienen una gran influencia en la calidad, el rendimiento y la pureza de los islotes. Quizás el paso más difícil técnicamente es la canalización del conducto biliar común. En muchos ratones, el conducto biliar común puede ser difícil de visualizar debido a la fascia que rodea. Por lo tanto, es común que los intentos para canalizar el resultado del conducto biliar común en la penetración del tejido facial solamente. En estos casos, la Liberase comienza a llenar el tejido conectivo circundante y no perfusión del páncreas. Si esto se detecta, detener el flujo de Liberase y la posición de la aguja para que penetre en el lumen de la vía biliar. Con la práctica, es posible identificar rápidamente la posición óptima para la colocación de la aguja y para completar la canalización sin dañar el conducto friable. 2. El trasplante de islotes Los pasos críticos son la inducción de la diabetes con STZ (5,1) y la prestación eficiente de los islotes de la bolsa subcapsular (5.3.14-5.3.16). STZ es un análogo de la glucosa natural que es selectivamente tóxica para las células de la secreción de insulina de las células β de los islotes 9. Sin embargo, esta toxicidad selectiva se produce en un rango de concentraciones relativamente estrecho. Prueba de ello es el hecho de que altas dosis de STZ puede resultar en un rápido (2-3 días) letalidad en ausencia de hiperglucemia. Por lo tanto, se debe tener cuidado para identificar la dosis óptima de STZ de la cepa y la edad de los ratones se utiliza antes de los experimentos a gran escala se inició. La entrega física de los islotes de la bolsa subcapsular es también un paso clave. Para lograr resultados consistentes, es imprescindible para reducir al mínimo la pérdida de islotes en su entrega. Esto puede ocurrir si hay defectos o roturas en la cápsula renal que cubre la bolsa o si el volumen inyectado es demasiado grande. El daño a la cápsula se puede evitar la manipulación suave y cuidadosa, y mediante el uso de la sonda de cristal liso para preparar la bolsa subcapsular. Además, el volumen de inyección puede ser minimizado con la extracción cuidadosa del sobrenadante en el paso 5.3.6.3. Si se retira el sobrenadante hasta el nivel de los islotes sedimentado, normalmente hay más que suficiente espacio en la bolsa subcapsular a cabo 400 a 500 islotes. Sin embargo, si el volumen de inyección es demasiado grande, los islotes son más propensos a fugas de la bolsa durante el proceso de trasplante, poniendo en peligro la reproducibilidad del experimento. Dentro de este protocolo, es posible modificar algunos de los pasos y aún así lograr resultados satisfactorios. Estos incluyen los siguientes: (a) el uso de una enzima diferente para digerir el páncreas, (b) un método diferente para la entrega de la enzima en el páncreas, (c) el uso de un continuo de Ficoll-diatrizoato de sodio (FSD) gradiente en lugar de la densidad de un solo paso Histopaque1077, y (d) trasplante de islotes a otros lugares de la subcapsule riñón. <ol class="lalpha"><li> En este protocolo, Liberase se utiliza para debilitar a los contactos célula-célula en el páncreas. Liberase es esencialmente una mezcla altamente purificada de colagenasas que han demostrado ser útiles en la liberación de los islotes del páncreas. No obstante, las colagenasas menos purificada son capaces de lograr un resultado similar. Por lo tanto, es posible utilizar diferentes preparados enzimáticos disponibles en el mercado para digerir el páncreas, siempre y cuando la condición de la digestión se ha optimizado para conseguir una calidad de islotes de alta, el rendimiento y la pureza. </li><li> También es posible para digerir el páncreas sin perfusión ductal de la enzima. La entrega de Liberase través del conducto biliar común permite una máxima exposición de la zona del páncreas superficie de la enzima. Esto da como resultado una digestión más aún del páncreas y una mayor liberación de los islotes intactos. Sin embargo, otras medidas para aumentar la superficie del páncreas para que la enzima se puede utilizar. Por ejemplo, picado el páncreas antes de incubar en Liberase o la inyección directa de Liberase través de la cápsula del páncreas puede ser usado para aislar los islotes. Sin embargo, ningún otro método de entrega Liberase es tan eficaz como la perfusión a través del conducto biliar común. Por lo tanto, la inyección de picado o directa debe reservarse como un último recurso, si el conducto biliar común está dañado y no perfusable. </li><li> Un método alternativo para la separación de los islotes de las células exocrinas implica lael uso de un gradiente de FSD en lugar de Histopaque1077 10. La separación eficiente de los islotes de células exocrinas en este protocolo se debe en parte a un diferencial de densidad entre los dos tipos de células. Histopaque1077 tiene una densidad de 1,0771 g / ml a 25 ° C. A esta temperatura, Histopaque es más denso que los islotes, pero menos densa que las células exocrinas. Por lo tanto, bajo la fuerza de centrifugación, Histopaque1077 gránulos de las células exocrinas, levantando los islotes a la superficie. En principio, cualquier otra sustancia con una densidad que puede separar los islotes de células exocrinas se pueden utilizar en este paso y el gradiente de FSD es una de esas sustancias. </li><li> Con respecto a la ubicación de los islotes del trasplante, la cápsula renal utilizados en este protocolo es uno de los pocos lugares posibles. Mientras que el subcapsule riñón es el sitio más frecuente de trasplante en ratones, el trasplante de otros sitios se han encontrado para ser eficaz y que incluyen la vena porta hepática, espacio subretiniano, testículos, almohadilla de grasa del epidídimo, el bazo, páncreas y hasta 11-14. Cada uno de estos lugares tiene sus propias ventajas y desafíos. Por lo tanto, la selección de un sitio para el trasplante de islotes debe ser determinado por las preguntas formuladas y las circunstancias específicas de los experimentos. </li></ol> Se cree que las estrategias que se pueden superar las limitaciones en el trasplante de islotes dramáticamente mejorar su potencial terapéutico. Por lo tanto, el uso de un modelo murino que se detallan en este protocolo ofrece un enfoque atractivo para la identificación de tales estrategias.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>31800-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liberase TL</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>05401020001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque1077</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Citrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S4641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptozotocin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S-0130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A144-212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vedco</td>
<td>ISOSOL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary Tubes</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22362574</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin Syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>329461</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>27 Gauge Syringe Needle</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>305109</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton Syringe #1702</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>14813133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10cm Petri Plates</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0875712</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6cm Petri Plates</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>07770212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-0 Suture</td>
<td>Equipment</td>
<td>Ethicon</td>
<td>8726H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE 50 Flexible Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>NC9083963</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5ml Disposable Syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>309603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50ml Conical Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15ml Conical Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1mm Nylon Mesh</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22363549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.419mm Wire Mesh</td>
<td>Equipment</td>
<td>Newark Wire Cloth Company</td>
<td>0300241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bath Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-462-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Microscope</td>
<td>Equipment</td>
<td>Zeiss</td>
<td>Stemi SV6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>Equipment</td>
<td>Nikon</td>
<td>TMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Napco</td>
<td>6300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS14393</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>McPherson-Vannas Scissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS15915</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemostatic Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>INS 500451</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane Nebulizer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Smiths Medical Surgivet</td>
<td>ISOTech 4 OHMEDA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Swing Bucket Centrifuge</td>
<td>Equipment</td>
<td>Dupont &#x2013; Sorvall</td>
<td>RT6000D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Swing Bucket Rotor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Dupont &#x2013; Sorvall</td>
<td>H1000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH Meter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Mettler Toledo/ Fisher Scientific</td>
<td>09313509</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel Loading Tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05408151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>p200 Tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>111-0730</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation

Desde los primeros trabajos pioneros de Ballinger y Reckard lo que demuestra que el trasplante de islotes de Langerhans en roedores diabéticos podrían normalizar sus niveles de glucosa en la sangre, el trasplante de islotes se ha propuesto ser un tratamiento potencial para la diabetes tipo 1 1,2. Más recientemente, los avances en trasplante de islotes humanos han fortalecido aún más este punto de vista 1,3. Sin embargo, dos limitaciones importantes evitar el trasplante de islotes de ser una realidad clínica generalizada: (a) la necesidad de un gran número de islotes por paciente, lo cual reduce considerablemente el número de beneficiarios potenciales, y (b) la necesidad de inmunosupresión pesado, que afecta de manera significativa la población pediátrica de los pacientes debido a su vulnerabilidad a la inmunosupresión a largo plazo. Las estrategias que se pueden superar estas limitaciones tienen el potencial para mejorar la utilidad terapéutica del trasplante de islotes. El trasplante de islotes bajo la cápsula renal ratón es un modelo ampliamente aceptado para investigar varias estrategias para mejorar el trasplante de islotes. Este experimento requiere el aislamiento de islotes de alta calidad y la implantación de islotes a los destinatarios de la diabetes. Ambos procedimientos requieren pasos de la cirugía que puede ser mejor demostrado por el vídeo que por texto. En este sentido, el documento los pasos detallados para estos procedimientos por el vídeo y el protocolo escrito. También brevemente los diferentes modelos de trasplante: singénico, autoinmunes alogénico, singénico y alogénico autoinmunes.

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

El trasplante de islotes aislados se ha propuesto ser un tratamiento potencial para la diabetes tipo 1. Aquí se describe un método para aislar los islotes de páncreas de ratón y trasplantarlas en el espacio subcapsular del riñón.

Un método para el aislamiento de los islotes murinos y Trasplante Renal subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

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