Name: atmospheric-pressure molecular imaging of biological tissues and biofilms by laesi mass spectrometry
Uploaded: 2010-09-03T17:00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry at JoVE.com

Författarna är tacksamma för finansiellt stöd till detta arbete av den amerikanska National Science Foundation i Grant nr 0719232, av US Department of Energy (DEFG02-01ER15129), och av Protea Biosciences, Inc. (Morgantown, WV). Författarna vill också tacka Jessica A. Stolee för hennes hjälp under videofilmning av protokollet.

Följande protokoll beskrivs de viktigaste stegen i laser ablation elektrospray jonisation (LAESI) experiment och ger representativa exempel för laterala och tredimensionella (3D) imaging för djur och växter vävnadsprov. Ytterligare experimentella och tekniska detaljer kan erhållas från annat håll. 1-6 1. Tissue Förberedelse och montering <ol><li> Om sektionering behövs, använd en cryomicrotome avsnitt vävnaden till 10-100 ìm tjocka skivor vid -10 till -20 ° C, om inte annat rekommenderas för en speciell vävnadstyp. </li><li> Montera delarna på en plan yta (t.ex. kemiskt förrengöras glasskiva) direkt utan kemiska modifierare. För sektioneras vävnader, tina-montera sektionerna och säkra provhållaren till ett Peltier-kylning steg omedelbart efter tö-montering för att hålla vävnaden fryst under hela analysen. Detta steg behövs för att minimera / förhindra molekylära migration i avsnittet. </li><li> Om det behövs använder en kylfläns utrustad med en strömsnål fläkt för att underlätta värmeavledning från Peltier-scenen för att hålla vävnaden frysas. </li><li> I en fuktig miljö under en längre tid (1-2 timmar), inspektera för kondensering av vatten eller is på vävnaden ytan. Kondens på vävnaden påverkar negativ för bildhantering prestanda i LAESI experiment. 1 </li><li> Om det behövs använder ett rum avfuktare eller placera kyls provet i en klimatkammare fylld med en inert gas (t.ex. kvävgas) för att förhindra kondens. 1 </li></ol> 2. Optimering av LAESI jonkälla Den LAESI jonkälla består av en mid-infraröd laser, en serie optiska element för lätta styrning och fokusering samt ytterligare innehavare prov, kyla komponenter, stadier översättning, och ett lösningsmedel leveranssystem. Figur 1 visar den typiska placeringen av dessa delar med hänsyn till ingången av det atmosfäriska tryck jonkälla av en masspektrometer. <ol><li> Som visas i figur 1, position provet 15-20 mm under öppningen av masspektrometer provtagning konan (D eller-FP). </li><li> Kör en mid-IR-laser på 2,94 ìm våglängd och 10 Hz repetitionsfrekvens. Dämpa laseruteffekten till ~ 100 μJ / pulsenergi. </li><li> Använd en kombination av guld speglar och en lins transparent på lasern våglängd (t.ex. en PLANKONVEX CaF 2 eller ZnSe objektiv) att koppla energi laserpuls in i urvalet vid vinkelrätt infall (se höger infallsvinkeln med avseende på provytan i figur 1). </li><li> Placera i mitten av infraröda strålen axel 5-8 mm framför mynningen av masspektrometer provtagning kon. </li><li> Justera fokus linsens position och pulsen energin i laserstrålen för att uppnå vävnad i fokus plats. Måtten på borttagen volym bestämma pixel (eller Voxel i tredimensionell avbildning) storlek för bildprogram. </li><li> Placera en nanospray emitter i linje med inloppet axel masspektrometer och en öppning till emitter spets avstånd på ~ 10 mm (se figur 1). </li><li> För elektrospray, förbereda 50% metanol lösning med 0,1% ättiksyra eller 0,1% ammoniumacetat tillsats för positiv eller negativ jon-läge, respektive. Beroende på provet, andra organiska lösningsmedel, såsom acetonitril, isopropanol, etc. kan ersätta metanol vid koncentrationer lämpliga för den analytiska uppgiften. Stabiliteten i elektrospray är avgörande för framgångsrik avbildning. Beroende på lösningsmedel urval, flödet och de sprutar spänning behöver justeras för att uppnå en stabil spray. </li><li> För reaktiva LAESI 6 i bildprogram, kan electrosprayed lösningen innehåller reaktanter. </li><li> Använd en sprutpump för att leverera elektrospray lösningen genom elektrospray sändaren med en flödeshastighet på ~ 300 Nl / min. </li><li> Om masspektrometer öppningen hålls på en låg spänning (&lt;500 V mätt mot jord), generera elektrospray genom att tillämpa hög spänning direkt till elektrospray emitter (t.ex. 3000 V) eller genom ett metallförband. Annars marken direkt elektrospray sändaren eller genom metall unionen att etablera elektrospray. </li><li> Använd elektrospray källa i kon-jet sprutning läget för de flesta effektiva jon generationen av LAESI. För effekten av driftvariabler på besprutning lägen och deras inverkan på massan spektra, se diskussionen någon annanstans. 5,7,8 </li><li> Försiktigt justera den relativa avstånden i LAESI setup för att optimera för LAESI jon avkastning samtidigt som laserstrålen, sändaren och axlarna öppning i samma plan. Här hittar du detaljerade anvisningar på annat håll. 5 </li><li> Med en optisk mikroskop, bestämmer laterala mått ablation krater på provet. </li><li> För tredimensionella LAESI avbildning experiment, utföra ablation med individuella pulser och hur djup en Voxel använda, till exempel z-stack mode i optisk mikroskopi. 3 </li></ol> 3. Molecular Imaging och dataanalys I avbildning experimentet är vävnadsprov flyttade i fokalplan lasern i X-och Y-led med steg storlekar större än eller lika med mått ablation plats. Den rumsliga upplösningen begränsas av fokusering av laserstrålen riktas. <ol><li> Välj område av intresse på provets yta och erhålla (X, Y) koordinaterna för motsvarande gränser. </li><li> Välj ett gridding algoritm (t.ex. adaptiv rutnät, valda regionen bildbehandling, rutnät, spiralmönster, Z scanning, etc) med vilka raster provets yta med utvalda Väntetid varje pixel över området som ska avbildas. </li><li> Använd en treaxlig översättning scenen och programvara som klarar av rastrering provet enligt förutbestämda nätet. </li><li> Beräkna den totala tid som krävs för avbildning. </li><li> Inaktivera uppgifter gränsen förvärvet tiden av masspektrometer. Om detta inte är möjligt, ställ in uppgifter gränsen förvärvet tid till det beräknade avbildning tidsvärde. </li><li> Starta mitten av infraröd laser källa vid en repetitionsfrekvens korrekt att producera tillräckligt med signal-brus-förhållandet i massan spektrum inom uppehållstiden vid varje pixel för att utföra en LAESI lateral avbildning experiment. För 3D molecular imaging, använd en kurs spektrum förvärv högre än laserkälla repetitionsfrekvens att framgångsrikt massa-analysera joner genereras i en enda laserpuls. Vänta på START-signal att inleda ablation sekvensen. </li><li> Slå på elektrospray källan. Se till att det finns tillräckligt med lösning för hela tiden som krävs för avbildning. </li><li> Samtidigt START förvärvet av massa spektra mitten av IR-laser ablation, och ytan skanning. </li><li> När avbildning körs är klar STOP ytan skanning, mitten av IR-lasern, och datainsamling. </li><li> Inaktivera laserkälla. </li><li> Stäng av hög spänning. </li><li> Stäng av sprutpump. </li><li> Ställ masspektrometer till viloläge. </li><li> Stäng av Peltier-kyla elektronik. </li><li> Stäng inert gas flöde om sådan används. </li><li> Använd en programvara för att korrelera absoluta koordinater pixlar i sidled avbildning eller voxlar i 3D analys med motsvarande spektra. </li><li> Plotta signalen jon intensiteten för en vald m / z värde mot den absoluta koordinater för analys för att få sidled och 3D molekylära bilder. </li></ol> 4. Representativa resultat Figur 2 ger representativa resultat för vissa viktiga vävnadstyper och villkor avbildning. Panel A visar ett fall för en animalisk vävnad avsnitt som har varit fryst under försöket att förhindra uttorkning. 1 Dessutom var provet i en torr kvävgas miljö för att undvika omgivande vatten ångor kondenseras på provets yta. En 100-ìm tjocka koronalt del av en råtta hjärna (Rattus norvegicus) var sidled avbildade med LAESI. Den anatomiska regioner i hjärnan (se optisk bild i panel A) visar god korrelation med de molekylära bilden erhålls för plasmalogens PC (O-33: 3) och / eller PE (O-36: 3) med m / z 728,559. Panel B visar 3D LAESI avbildning av en Zebra anläggning (Aphelandra squarrosa) bladvävnad. Eftersom bladen har en naturlig försvarsmekanism mot uttorkning, kan provet förhördes i den omgivande miljön. Erhålls 3D molekylära bilder visade en rad olika utbredningsmönster för primära och sekundära metaboliter 3. Bland annat var acacetin med m / z 285,076 upptäcks vid högre jon räknas i den gula sektorer av den andra och tredje lager från toppen med en homogen fördelning i de övriga. Denna fördelning avtalas med mönster av färgskiftning ses i den optiska bilden. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Schematisk av LAESI systemet (ES, elektrospray emitter spets, eller öppning av masspektrometer provtagning kon, FL, med fokus lins, FP, brännpunkt, P, Peltier kylning stadium, HS, kylfläns). En del av partiklar utvisad under mitten av IR-ablation (röda prickar) sammanbinds med elektrospray att ge laddade droppar ympats med molekyler och joner i provet (gröna prickar). Jonerna frigörs från dessa droppar analyseras och registreras av masspektrometer. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Representativa resultat för lateral och 3D fantasi. ng med LAESI masspektrometri (A) Den övre panelen visar den optiska bilden av en råtta hjärna (Rattus norvegicus) koronala avsnitt och den molekylära bilden erhålls för plasmalogens PC (O-33: 3) och / eller PE (O-36 : 3) med m / z 728,559. Den vita Skalningsfält motsvarar 1 mm. Anpassad med tillstånd från (referens 1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) Den nedre panelen visar 3D-avbildning av ett blad från en brokig Zebra anläggning (Aphelandra squarrosa). Acacetin med m / z 285,076 upptäcktes vid högre jon räknas i den gula sektorer av den andra och tredje lager från toppen med en homogen fördelning i de övriga. Återges med tillstånd från (referens 3). Copyright 2009 American Chemical Society.

<ol>
	<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure,+in+vivo,+and+imaging+mass+spectrometry.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li><li>Nemes, P., Vertes, A., Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure+molecular+imaging+mass+spectrometry.+Mass+Spectrometry+Imaging.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry.">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li><li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays.">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li><li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization.">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li><li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry.">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li><li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li><li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+mass+spectrometry.">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li></ol>

Olika vävnadstyper uppvisar varierande vattenhalt och draghållfasthet, som i sin tur kan påverka ablation egenskaper proverna. 9 För att minska dessa effekter är det önskas att lasern fluensen, provhantering och analys protokoll revideras vid byte mellan stora vävnadstyper. För enstaka cell eller högre undersökningar upplösning, kan mitten av infrarött ljus kopplas till en skärpt optisk fiber i stället för en lins. 10 Genom att placera fiberspetsen i närheten av de markerade cellerna i en vävnad kan LAESI analys utföras på en encelliga nivå. Som en etikett utan jonkälla för omgivande jonisering masspektrometri har 11 LAESI visat stor potential för utredning av biokemiska processer i vävnader. Med den extra fördelar av direkt analys, lateral och 3D-avbildning, är LAESI en framväxande bioanalytiska verktyg för profilering som tillämpningar avbildning.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mass spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters Co. (Milford, MA)</td>
<td>Q-TOF Premier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mid-IR laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td>
<td>Vibrant IR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

atmospheric-pressure molecular imaging of biological tissues and biofilms by laesi mass spectrometry

Omgivande jonisering metoder i masspektrometri möjliggör analytiska undersökningar som ska utföras direkt på vävnad eller biofilm i native-liknande experiment. Laser ablation elektrospray jonisation (LAESI) är en sådan utveckling och är särskilt väl lämpad för utredning av vatten-innehållande prover. LAESI använder en mid-infraröd laserstråle (2,94 ìm våglängd) för att excitera vattenmolekylerna av provet. När ablation fluensen överskrids, är provmaterialet utvisades i form av partiklar och dessa projektiler resa till tiotals millimeter över provets yta. I LAESI är detta ablation plym stoppad av laddade droppar för att fånga en bråkdel av den utkastade provmaterial och omvandla dess kemiska beståndsdelar i gasfas joner. En masspektrometer försedd med ett atmosfäriskt tryck jonkälla gränssnitt är anställd för att analysera och registrera sammansättning frigörs joner som härrör från sonderade området (pixel) av provet. En systematisk förhör över en rad pixlar öppnar en väg för molekylär bildanalys i mikrosondanalys läget. En unik aspekt av LAESI masspektrometriska bildbehandling är djup profilering som i kombination med laterala imaging, möjliggör tredimensionella (3D) molekylär bildanalys. Med dagens sidled och djup resolutioner av ~ 100 ìm och ~ 40 ìm, respektive hjälper LAESI masspektrometrisk bildbehandling för att utforska den molekylära strukturen av biologiska vävnader. Häri går vi igenom de viktigaste delarna av en LAESI system och ge riktlinjer för en lyckad avbildning experiment.

Watch this Scientific Journal Video about Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry at JoVE.com

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Laser ablation elektrospray jonisation (LAESI) är ett atmosfäriskt tryck jonkälla för masspektrometri. I avbildning läget en mid-infraröd laser prober fördelningarna av molekyler över en vävnad avsnitt eller en biofilm. Denna teknik presenterar en ny metod för olika bioanalytiska studier som utförs under infödda experimentella förhållanden.

Atmosfäriskt tryck Molecular Imaging av biologisk vävnad och Biofilmer av LAESI masspektrometri

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Analysera stora proteinkomplex från struktur-masspektrometri

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

T-vågen Ion Mobility-masspektrometri: Grundläggande experimentell Rutiner för Protein Komplex analys

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Direkt analys av enskilda celler med masspektrometri vid atmosfärstryck

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering Tiol Redox Proteome Användning Isotope spektrometri Taggning Mäss

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Högtrycks Frysning och Quick Freeze Substitution av växtvävnad för transmissionselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anrikning av extracellulära matrixproteiner från vävnader och matsmältning i peptider för masspektrometri analys

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Tillämpningar av Single-sonden: masspektrometri Imaging och Single cellanalys under normala förhållanden

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

Kvantitativa lokalisering av ett Golgi Protein av Imaging Center av fluorescens massan

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...