Name: genome-wide analysis using chip to identify isoform-specific gene targets
Uploaded: 2010-07-07T17:00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets at JoVE.com

Bu çalışma NIH den 115.347-RSG-08-271-01-GMC ACS ve CA138631 tarafından hibe tarafından desteklenmiştir.

Protokol başlangıçta B. Ren, 2001 uyarlanmıştır. Odom ve arkadaşları tarafından protokol hafif bir değişiklik temsil eder. Bulunabilir 5 <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. Ön-blok ve manyetik boncuk antikor bağlayıcı (sonraki adım, bir gece önce uygulanmalı) <ol><li> 1 ml taze BSA / PBS solüsyonu (50 mg 10 ml BSA PBS-Bu çözüm, bir hafta boyunca sürecek). Dynabeads Protein G 100 mcL yıkayın (IP başına birden fazla IP adresleri için, birleştirmek) </li><li> Manyetik bir stand boncuklar kullanarak toplayın ve yıkama işlemi iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Sonra, ul PBS / BSA çözüm boncuk bulamaç (IP başına) 250 10 mikrogram antikor ve 4 geceleme dönen bir platform üzerinde inkübe ° C </li><li> Tamamlandığında, PBS / BSA çözüm 1 ml boncuk üç defa yıkamak ve sonra PBS / BSA çözüm (IP başına) 10 ul tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> 2. Hücre çapraz bağlama <ol><li> Bu yordamı başlamak için, yaklaşık 10 8, her immunoprecipitation hücre, ya da IP büyür . Burada, diffüz histiyositik lenfoma U937 hücrelerinin kullanılan ve 96 saat TPA ile monositik farklılaşma için uyarılan. </li><li> Hücre büyümesinin ardından, doğrudan nihai konsantrasyonu% 1 ortam formaldehit ekleyin. Daha sonra, onları 10 dakika boyunca oda sıcaklığında oturup girdap şişeler kısaca ve izin verir. Sonra, medya aspire hücreleri ve buz gibi soğuk PBS 15 ml ile durulayın. Bu yıkama bir kez tekrarlayın. </li><li> Daha sonra, her 6 Lizis Tampon 1 ml (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 10 gliserol,% 0,5 &#39;NP-40, Triton proteaz inhibitörleri içeren X-100,% 0.25) buz üzerinde şişe. Daha sonra, 4 için en az 20 dakika şişeler kaya ° C </li><li> Son olarak, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücrelerin hasat ve 15 ml konik tüpler aktarabilirsiniz. Bu noktada hücreler, -80 ° C&#39;de saklanabilir </li></ol> 3. Hücre Sonikasyon <ol><li> Hücreler dondurulmuş olsaydı, onları Çözülme. Çözülmüş sonra, 10 dakika 3.000 rpm&#39;de 4 hücreleri aşağı dönmeye ° C ve supernatant atın. Sonra, Lizis Tamponu 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1mm EDTA, 0.5 mM EGTA, proteaz inhibitörleri içeren) mL 6 hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça Rock tüpler. </li><li> Santrifüj tekrarlayın ve 2.5 mL Lizis Tampon 3 (proteaz inhibitörleri içeren 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA,% 0,1 sodyum deoksikolatın, 0,5% N lauroylsarcosine,) hücrelerin tekrar süspansiyon . </li><li> Sonra, 50 ve% 60 genlik arasında bir Branson 450 Sonifier mikrotip buzlu su behere koyarak sonication için süspansiyon hazırlamak. </li><li> Çözüm için, 1 dakika buz üzerinde 30 saniye sabit bir patlama ve serin sonikasyon. Bu bakliyat, 10 ila 15 kez tekrarlayın. Daha sonra, tüpün içeriğini pipet ve aşağı ve yeni bir tüp aktarabilirsiniz. Ek bir 5 kez nabız ve çözüm soğutmak için devam edin. </li><li> Sonication ardından,% 10 Triton X-100 çözümü hacminin 1 / 10. 1,5 mL santrifüj tüplerine lizatları aktarın ve bir mikrosantrifüj enkaz döndürün. Sonra yeni bir tüp hücre lizat aktarın. </li></ol> 4. Kromatin Immunoprecipitation <ol><li> Kromatin immunoprecipitation veya ChIP önce giriş örnek olarak hücre lizat 50 mcL kaydedin. Sonra, Dynabeads yukarıda açıklandığı gibi önceden hazırlanmış antikor ön bağlı temizlenir hücre lizat birleştirir. 4 ° C gecede, 50 mcL giriş örnek ek olarak, Rock karışımı. </li><li> Yıkama Tamponu 1 mL (50 mM Hepes KOH, pH 7.6, 0.5 M LiCl, 1mm EDTA,% 0.7 sodyum deoksikolatın,% 1 NP-40) ile boncuk yıkayın. Daha sonra manyetik bir stand, boncuk toplamak ve süpernatant kaldırmak için kullanın. Bu yıkama 6 ila 8 kez tekrarlayın. </li><li> Ile son yıkama gerçekleştirin 1 ml TE-artı-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). 2 dakika 3.000 rpm&#39;de mikrosantrifüj boncuk Spin 4 ° C Santrifüj sonrasında, herhangi bir kalıntı TE tampon aspirat. </li><li> Sonra, örnekleri Elüsyon Tampon (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA,% 1 SDS) 100 mcL ekleyin. Hemen sonra, 65 numunelerin inkübasyon ° C&#39;de 10 ila 15 dakika. Süspansiyon boncuk tutmak için 1.5 ml tüp raf her 2 dakikada karşı tüpler kazıyın. </li><li> Santrifüj ve manyetik standı kullanarak boncuk toplamak ve PCR tüp süpernatantı transfer. Sonra, önceden kaydedilmiş bir giriş örnek almak ve Elüsyon Tampon 3 cilt. </li><li> Son olarak, 65 gece termal cycler içine IP ve giriş örnekleri yerde ° Cçapraz bağlantıların ters. </li><li> Ertesi gün, örnekleri TE tampon 1 hacim ekleyin. Daha sonra, nihai konsantrasyonu 0.2 mg / ml RNaz A ekleyin. 37 için 1 ila 2 saat termal cycler örnekleri inkübe ° C </li><li> Inkübasyondan sonra, nihai konsantrasyonu 0.2 mg / ml proteinaz K ekleyin. Daha sonra, 2 saat boyunca termal cycler numune 55 ° C&#39;de inkübe. </li><li> Sonra, fenol ile bir kez, bir ses örnekleri ayıklayın. Kloroform: izoamil alkol, fenol, bir ses örnekleri ikinci kez ayıklayın. Izoamil alkol: Son olarak, bir kez daha bir hacim kloroform örnekleri ayıklamak. </li><li> Sonra, her bir örnek için 30 mg glikojen ekleyin. Ayrıca, numunelerin etanol 0.2 Molar ve iki ciltlik bir son konsantrasyonu NaCl ekleyin. 30 dakika inkübe -80 ° C Inkübasyondan sonra, numuneler ve spin süpernatantı süzün. Pelet 500 mcL% 75 etanol ile yıkayın. Sonra, pelet ve kuru onlara su 40 mcL yeniden askıya. </li><li> Sonication prosedürü tarafından üretilen DNA parçalarının boyutları kontrol etmek için,% 1.8 agaroz jel 5 mikrogram, arıtılmış giriş örnek jel yüklemek ve çalıştırmak. Sonication prosedürü aralığı 150-350 baz çifti parçaları üretmek gerekir. Ancak, bu aralığın parçaları düşmeyin eğer sonication prosedürü patlamaları ve genlik sayısı değiştirerek ayarlanabilir olmalıdır. </li><li> 1 IP örneklerinin ul ve seyreltme serisi ile girdi örnek bir gen-spesifik PCR gerçekleştirerek kontrolü bağlayıcı bölgelerde zenginleştirme ChIP sağlamlık ve özgünlüğü kontrol için. IP ve giriş örnekleri kalitesini test etmek için iki ya da üç &quot;bound&quot; bölgeler ve ilişkisiz bir kontrol bölgesi seçilmesi gerekir. </li></ol> 5. Genomik DNA amplifikasyonu <ol><li> IP giriş numune numune veya 200 ng 34 ul ile başlayarak, son onarım, Genomik DNA Sample Hazırlık Seti kullanarak DNA parçalarının &#39;A&#39; kuyruk ek ve adaptörleri ligasyonu gerçekleştirmek <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, Inc, San Diego, CA). </li><li> MinElute PCR Arıtma kiti kullanılarak DNA arındırmak ve daha sonra 50 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış edildiğini tampon EB (10 mM Tris Cl, pH 8.5) Zehir Örneğin, sırasıyla, IP ve giriş DNA örnekleri son yürütülmesi için 23 mcL ve 46 mcL kullanın. </li><li> 20 mcM Sol_PCR_2 mcL adaptörleri ile DNA&#39;nın 23 mcL kullanarak PCR ve kit 25 mcL Phusion DNA polimeraz, 20 mcM Sol_PCR_1 1 mcL, ve 1 yapın. PCR reaksiyonu aşağıdaki gibi çalıştırın: 98, 2) 10 saniye 98 ° C, 3) 30 saniye 65 ° C ° C 1) 4) 30 saniye 30 saniye 72 ° C; adımları yineleyerek adım 2-4 18 72 kez ve daha sonra 5 dakika ° C, son olarak 4 tutarak ° C </li><li> PCR ardından QIAGEN MinElute PCR Arıtma Kiti ile DNA arındırmak. Ön tampon EB-50 sıcak 15 mcL ° C ve DNA Zehir. Örnek 01:04 0.5 mcL seyreltilir ve bir Nanodrop okuma yapmak. </li></ol> 6. Amplifiye ürünlerin Jel arıtma <ol><li> Çoğaltılan ürünlerin arındırmak için, HPLC-sınıf su kullanarak 50 ml% 1.8 agaroz jel hazırlayın. TAE ve etidyum bromür agaroz erimesinden sonra ekleyin. Daha sonra, jel dökün. Giriş ve IP örnekleri yükleme tamponu 4 mcL ekledikten sonra jel yükleyin. Daha sonra, 45 dakika için 120 volt jel çalıştırın. </li><li> Çalıştırıldıktan sonra jel analiz edin. Jel, 150 ve 350 baz çifti üretilir aralığında o parçaları ortaya çıkarmak gerekir. 50 ve 250 baz çiftleri arasındaki uzunluk ve bir adaptör genomik DNA parçaları temsil eder. </li><li> Vergi bir neşter ile 150 350 baz çifti aralığı madde içeren jel bölgesi. Adaptörü adaptörü bant eksize önlemek için dikkat edin, yaklaşık 120 baz çifti çalışır. Üreticinin talimatlarına göre bir QIAquick Jel Ekstraksiyon kiti kullanılarak DNA kurtarın. Özellikle QIAquick Jel Ekstraksiyon Kit, 400 mg veya daha az bir jel dilim için bir sütun kullanabilirsiniz. Ekstraksiyon işlemine başlamak için 3 cilt, 1 hacim jel tampon QG ekleyin. 1 hacim izopropanol ekleyin ve sütun karışımı yük. 0.5 ml QG sütun yıkamak için kullanın, kiti kılavuzda açıklanan standart prosedür takip etti. H 2 O önceden ısıtılmış 50 ° C DNA Zehir. 37 az 5 dakika 30 H 2 O ul sütun ° C&#39;de aşağı iplik önce. </li><li> Kuru ısı olmadan Speedvac tam 11 mcL aşağı örnek. Örnek 1 mcL çıkarın ve Nanodrop spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu ölçmek. </li><li> Son olarak, açıklanan Illumina Genom AnalyzerIIe kullanarak zenginleştirilmiş gen ürünleri belirlemek <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl</a>6 / 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Aşağıdaki deneme genel amacı KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase genomik hedefler belirlemektir. (P1) Bu, uygun büyüklükte DNA parçaları üretmek için sonicated, çapraz bağlantılı kromatin hazırlanması ile elde edilir. (P2) ikinci bir adım olarak, RBP2 bağlı DNA parçaları RBP2 antikorlar immunoprecipitated. Sonraki (P3), kurtarılan DNA parçalarının ucunda tamir ve adaptörleri Illumina Küme Station akış hücreleri genomik DNA analizi için kütüphaneler hazırlamak için genomik DNA ucu üzerine bağlandı. DNA kütüphaneler döngü az sayıda kullanarak PCR ile güçlendirilir. (P4) Son olarak, aydınlatıcı sıralı kısa benzersiz insan genomu hizalanır okur, önemli zirveleri RBP2 zenginleştirilmiş bölgeleri tanımlamak için tanımlanan ve en yakın genlere açıklamalı vardır. (P5) Sonuçlar RBP2 zenginleştirilmiş bölgelerin genom kimlik dayalı RBP2 hedef genleri ile ilişkili moleküler fonksiyonları elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Sonication prosedürü tarafından üretilen DNA parçalarının boyutlarını kontrol etmek için kromatin sonication sonuçlarını kontrol etmek, 5 mg (1 / 10), saflaştırılmış giriş numunenin% 1.8 agaroz jel üzerinde yüklenmiştir . Beklendiği gibi, bizim sonication işlem aralığı 150-350 bp parçaları üretti. Ancak, bu aralığın parçaları düşmeyin eğer sonication prosedürü patlamaları ve genlik sayısı değişen, buna göre ayarlanabilir olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Amplifiye ürünler Jel arıtma PCR ürünleri adaptörleri kaldırmak ve küme yeni nesil platform için şablonlar bir boyut aralığı seçmek için bir jel üzerinde çalıştırılır. Bu jel, 150 ve 350 baz çifti aralığında üretilen parçaları olduğunu gösterir. 50 ve 250 baz çiftleri arasındaki uzunluk ve bir adaptör genomik DNA parçaları temsil eder. Bir neşter ile jel tüketim Seçili bölge. Bakım yaklaşık 120 baz çifti çalışır adaptörü adaptörü bant önlemek için alınmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Izoform-spesifik antikor RBP2 büyük ve küçük izoformları arasında ayırım sağlar. RBP2 protein yapısı etki alanı görünümünde sunulmaktadır . Katalitik histon demetilasyon JmjC etki alanı ve ilişkili JmjN etki, sekans spesifik DNA bağlanmasını, potansiyel DNA veya diğer proteinler ve çok sayıda PHD alanlarını ile etkileşime girebilir C5HC2 çinko parmak yeteneğine sahip bir KURAK etki alanı: RBP2 birkaç etki alanı içerir. RBP2 izoformları arasında ayırt izin iki anti-RBP2 antikorlar, kalın çizgi ile gösterilen RBP2 parçaları karşı elde edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="Şekil 5a" /> Şekil 5a. Kromozom ve Ensembl genleri ile birlikte RBP2 bağlayıcı bölgelerin Genel Bakış. Genomik koordinatları (tüm izoformlarını ve büyük izoformu) bağlayıcı bölgeleri tespit zenginleştirilmiş RBP2 kromozom bilge sunulmaktadır. Ensembl genler Occupances (sürüm 54; hg18) kromozomlarda (Bu resim 10 kromozom) siyah çubuklar (üst panel) olarak sunulmuştur. Her RBP2 bağlayıcı bölgenin orta paneli tüm RBP2 izoformları kromozom 10 üzerinde bağlayıcı bölgeleri gösterir dikey bir çizgi olarak temsil ve alt panel RBP2 büyük izoformu bağlayıcı bölgeleri gösterir. Orta ve alt paneller örtüşen bakış ve kromozom 10 RBP2 izoformları belirli doluluk verir. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="Şekil 5b" /> Şekil 5b. RBP2 hedef genlerin fonksiyonel zenginleştirme analizi. İlgi haritası FDR gösteren zenginleştirilmiş RBP2 (ve büyük tüm izoformları) (genler yakın RBP2 bağlayıcı bölgeye) bağlı genler arasında Moleküler Fonksiyon kategoriler GO (p-değeri ≤ 0.05) önemli ölçüde düzeltilmiş. Kırmızıya doğru renkler yüksek istatistik önemi gösterir, sarı düşük istatistik önemi gösterir ve gri hiçbir istatistik önemi gösterir. Zenginleştirme analizi RBP2 hedef genlerin birbiriyle örtüşen ve izoform spesifik moleküler fonksiyonları gösterir.

<ol>
	<li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger.">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation.">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li><li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation.">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation.">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li><li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li><li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia.">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li></ol>

RBP2 izoformları arasında işlevsel farklılıklar tespit edilmemiştir. Biz RBP2 izoformları bağlı genomik bölgelerin belirlenmesi ve bu bölgelerde temsil ettiği fonksiyonel kategoride tanımlamak için kapsamlı bir yaklaşım kullandık. Bu elde edilen dizisi biyoinformatik analiz okur takip ChIP Seq analizi ile gerçekleştirildi. RBP2 histon kuyrukları metil lizin kalıntılarının değiştirir. Biz RBP2 büyük izoformu, insan genomu (Şekil 5A) farklı bölgelerinde bu modül bağlama eksik metil histon lisin ve RBP2 küçük izoformu için tanıma modülü içeren bulundu. Önemlisi, izoform belirli bölgelerde ve örtüşen bölgelerinde farklı moleküler fonksiyonları (Şekil 5B) ile genler aittir. Örneğin, &quot;kromatin bağlayıcı&quot; ve &quot;transkripsiyon faktörü bağlayıcı&quot; fonksiyonları RBP2 küçük izoformu gen hedefleri atfedilen olabilir ama değil RBP2 büyük izoformu (Şekil 5B). Gerçek gen karşılaştırarak büyük izoformu özellikle bazı genlerin işe ise tüm izoformları ve RBP2 büyük izoformu (veriler gösterilmemiştir) için, biz de tanımlayabilirsiniz oluşturulan ayarlar.

Oligonükleotid dizileri 2006 Illumina, Inc Tüm hakları saklıdır. <ul><li> Sol_PCR_1 Sıra 5&#39;-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TTK CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 Sıra 5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li></ul>

genome-wide analysis using chip to identify isoform-specific gene targets

Hedeflerine transkripsiyonel ve epigenetik faktörlerin İşe Alım kendi düzenlenmesinde önemli bir adım. Göze çarpacak belirli histon modifikasyonları bağlamak protein etki işe özellikli. Böyle bir etki birkaç kromatin bağlayıcı proteinler bulunan bitki homeodomain (PHD). Epigenetik faktörü RBP2 birden fazla PHD etki vardır, ancak, farklı işlevleri vardır (Şekil 4). Özellikle, bir insan lösemi RBP2 onkojenik füzyon bulunan C-terminal PHD etki alanı, histon H3 (H3K4me3) 1 lizin 4 trimethylated bağlanır. C-terminal PHD içeren RBP2 izoformu karşılık gelen transkript 2 monositler içine promonocytic, lenfoma kaynaklı, U937 hücrelerinin farklılaşma sırasında birikir. Her iki veri setleri ile tutarlı olarak, genom analizi farklılaştırılmış U937 hücrelerinde RBP2 protein H3K4me3 3 için yüksek derecede zenginleştirilmiş genomik bölgelerde lokalize aldığını gösterdi. Için RBP2 hedeflerine Yerelleştirme H3K4me3 RBP2 histon demethylase aktivite ve transkripsiyonel aktivite azalması nedeniyle bir azalma ile ilişkilidir. Buna karşılık, RBP2 iki diğer doktoralıların H3K4me3 bağlamak mümkün değildir. Özellikle, RBP2 C-terminal etki alanı PHD küçük RBP2 izoform 4 yoktur. H3K4me3 ile etkileşim yoksun RBP2, küçük izoformu genomik yerde büyük izoformu farklıdır düşünülebilir. RBP2 izoformları genomik yerde fark RBP2 fonksiyonunda gözlenen çeşitlilik için hesap. Özellikle, RBP2 retinoblastom protein (pRB) aracılığı ile hücre farklılaşmasında önemli bir oyuncu. 2) bir RBP2 bağlı genler farklılaşma-1) RBP2 farklılaşma bağımsız bir şekilde bağlı genler: izoformları arasında ayrım gözetmeksizin bu veriler, daha önceki genom analizi ile uyumlu olarak, iki ayrı grupta RBP2 hedef genlerin tespit bağımlı bir şekilde. Izoformları arasında yerelleştirme farkları belirlemek için ChIP-Seq genom yer analizi yapıldı. Hepimiz RBP2 hedefleri bulunan iki RBP2 izoformları tespit antikorlar kullanma. Ayrıca biz sadece büyük ve küçük RBP2 izoform (Şekil 4) bağlayan antikorlar var. Büyük izoformu hedefler belirledikten sonra, bir sonra küçük izoformu hedefleri ortaya çıkarmak için tüm RBP2 hedeflerden çıkarabilirsiniz. Bu veriler katkı genomunda bağlayıcı sitelerine protein alımında kromatin-etkileşim etki göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets at JoVE.com

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Burada bir histon bağlayıcı etki alanı farklı protein izoformları genom konum analizi için bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) prosedürü sunuyoruz. Biz KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase hedefleri belirlemek için ChIP-Seq analiz uygulayarak.

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Mikroarray&#39;ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

Çeşitli ChIPseq Veri Türleri Genom çapında Analizi İçin Yeni Bir Bayesian değiştir nokta Algoritması

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...