Name: induction and assessment of class switch recombination in purified murine b cells
Uploaded: 2010-08-13T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells at JoVE.com

We zijn dankbaar voor de Martin laboratorium voor nuttige discussies. Deze publicatie wordt ondersteund door een subsidie ​​van het Canadian Institute of Health Research (MOP-89783). AM wordt ondersteund door een Canada Research Chair Tier II Award.

Stap I: Isolatie van milt B-cellen via magnetische verrijking <ol><li> Experimentele muizen moet worden leeftijd van 8-12 weken op volle rijping van het immuunsysteem te verzekeren. </li><li> Euthanaseren de muis door cervicale dislocatie en genieten in 70% ethanol. Chirurgisch te verwijderen van de milt door het maken van een incisie door de huid en spieren van de linker hypochondrium van de buik en snijd het in drie grote stukken in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Zorg ervoor dat alle instrumenten en reagent...

<ol>
	<li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number.">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li><li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes.">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li><li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination.">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li><li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells.">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li><li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation.">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li><li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNF8/RNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination.">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li><li>Zaheen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+constrains+germinal+center+size+by+rendering+B+cells+susceptible+to+apoptosis.">AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis.</a> Blood. 114, 547-554 (2009).</li><li>Chaudhuri, J., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class-switch+recombination:+interplay+of+transcription,+DNA+deamination+and+DNA+repair.">Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair.</a> Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).</li><li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli+that+enhance+IgA+class+switching+increase+histone+3+acetylation+at+S+alpha,+but+poorly+stimulate+sequential+switching+from+IgG2b.">Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b.</a> Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).</li><li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+class+switching+differs+among+SJL,+C57BL/6+and+129+mice.">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li></ol>

Het protocol hierboven geschetste biedt een standaard test om AID expressie en functie analyseert tijdens de les schakelen van de primaire muizen B-cellen. Dit protocol maakt gebruik van bacteriële LPS te induceren schakelen van IgM naar IgG3, maar aanpassingen aan de stimulatie media kan worden gemaakt om te bewegen te schakelen naar andere isotypen (samengevat in Tabel 1 8, 9). We hebben opgemerkt dat, voor nog onbekende redenen, foetaal kalf serum kan het niveau van de klasse ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemcell Technologies</td>
<td>19754</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Falcon</td>
<td>352058</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C34554</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30072.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI 1640 Culture Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>L6529</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30396.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Mouse Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>011-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Pharmingen</td>
<td>553141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Anti-Mouse IgG3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Pharmingen</td>
<td>553401</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

induction and assessment of class switch recombination in purified murine b cells

Humorale immuniteit is de tak van het immuunsysteem onderhouden door B-cellen en gemedieerd door de secretie van antilichamen. Bij de B-cel activatie, de immunoglobuline locus ondergaat een reeks van genetische modificaties te veranderen het bindend vermogen en effector functie van de uitgescheiden antilichamen. Dit proces wordt benadrukt door een genomische recombinatie gebeurtenis bekend als klasse switch recombinatie (CSR), waarin de standaard IgM-antilichaam isotype is vervangen door een van de IgG, IgA of IgE. Elke isotype beschikt over verschillende effector functies waardoor MVO cruciaal voor het behoud van de immuniteit. Diversificatie van de immunoglobuline locus wordt gemedieerd door het enzym activatie-geïnduceerde cytidinedeaminase (AID). Een schematische video beschrijft dit proces in detail is online beschikbaar (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID activiteit en het MVO-pad worden over het algemeen bestudeerd in de beoordeling van de B-cel functie en humorale immuniteit bij muizen. Het protocol beschreven in dit rapport presenteert een methode van B-cel isolatie van murine milt en de daaropvolgende stimulatie met bacteriële lipopolysaccharide (LPS) te bewegen klasse overschakelen naar IgG3 (voor andere antilichaam isotypes zie tabel 1). Daarnaast is de fluorescente kleurstof cel vlekken carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) gebruikt om de celdeling van de gestimuleerde cellen, een proces dat van cruciaal belang om over te stappen 1, 2 isotype monitor. De regulering van de AID en het mechanisme waarmee MVO gebeurt nog steeds onduidelijk en dus in-vitro-klasse switch testen leveren een betrouwbare methode voor het testen van deze processen in verschillende muismodellen. Deze testen zijn eerder gebruikt in de context van gen-deficiëntie gebruik van knock-out muizen 3. Bovendien kan in vitro schakelen van B-cellen worden voorafgegaan door virale transductie voor het moduleren van genexpressie door RNA knockdown of transgenexpressie 4-6. De gegevens van dit soort experimenten hebben beïnvloed ons begrip van de AID activiteit, resolutie van de MVO-reactie, en antilichaam-gemedieerde immuniteit in de muis.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells at JoVE.com

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Na blootstelling aan antigeen, subpopulaties van geactiveerde B-cellen worden onderworpen aan een proces dat bekend staat als klasse switch recombinatie (CSR) van antilichamen isotypen te produceren met verschillende effector functies. Het protocol beschreven in dit rapport legt uit hoe MVO kan worden opgewekt en geanalyseerd<em&gt; In vitro</em&gt; Voor de doeleinden van het bestuderen van B-cel-functie.

Inductie en beoordeling van klasse Switch recombinatie in gezuiverd Murine B-cellen

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Detectie van True IgE-expressie muis B Lineage Cellen

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Beoordeling van de immuno-modulerende eigenschappen van humane mesenchymale stamcellen (MSC)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Een muizenmodel van groep B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginale Kolonisatie

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometrische analyse van deeltjes gebonden Bet v 1 allergeen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

Genoom-brede analyse van HDAC-Inhibitor-gemedieerde modulatie van microRNAs en mRNAs in B cellen geïnduceerde Undergo klasse-switch DNA recombinatie en Plasma celdifferentiatie

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

In Vitro en In Vivo beoordeling van T-, B- en myeloïde cellen onderdrukkende activiteit en humorale reacties van transplantatie ontvangers

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analyse van Shear Flow-geïnduceerde migratie van RattenUitrustingen Marginal Zone B cellen In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...