Name: induction and assessment of class switch recombination in purified murine b cells
Uploaded: 2010-08-13T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells at JoVE.com

Siamo grati al laboratorio Martin per utili discussioni. Questa pubblicazione è sostenuta da una sovvenzione da parte del Canadian Institute of Health Research (MOP-89783). AM è supportata da un Canada Research Chair Premio Tier II.

Fase I: isolamento delle cellule B della milza attraverso l&#39;arricchimento magnetico <ol><li> Topi sperimentali devono essere di età compresa tra 8-12 settimane per garantire la piena maturazione del sistema immunitario. </li><li> Euthanize il mouse dislocazione cervicale e immergersi in etanolo al 70%. Rimuovere chirurgicamente la milza facendo un&#39;incisione attraverso la pelle ei muscoli del ipocondrio sinistro dell&#39;addome e tagliata in tre pezzi grossi in tampone fosfato (PBS). Garantire tutti gli strume...

<ol>
	<li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number.">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li><li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes.">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li><li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination.">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li><li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells.">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li><li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation.">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li><li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNF8/RNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination.">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li><li>Zaheen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+constrains+germinal+center+size+by+rendering+B+cells+susceptible+to+apoptosis.">AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis.</a> Blood. 114, 547-554 (2009).</li><li>Chaudhuri, J., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class-switch+recombination:+interplay+of+transcription,+DNA+deamination+and+DNA+repair.">Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair.</a> Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).</li><li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli+that+enhance+IgA+class+switching+increase+histone+3+acetylation+at+S+alpha,+but+poorly+stimulate+sequential+switching+from+IgG2b.">Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b.</a> Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).</li><li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+class+switching+differs+among+SJL,+C57BL/6+and+129+mice.">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li></ol>

Il protocollo di cui sopra fornisce un test standard per analizzare l&#39;espressione AID e funzione durante la commutazione di classe delle primarie cellule B murini. Questo protocollo utilizza LPS batterici per indurre il passaggio da IgM a IgG3, anche se le modifiche ai mezzi di stimolazione può essere fatto per indurre il passaggio ad altri isotipi (riassunti nella Tabella 1 8, 9). Abbiamo notato che, per ragioni ancora sconosciute, siero di vitello fetale possono influenzare...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemcell Technologies</td>
<td>19754</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Falcon</td>
<td>352058</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C34554</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30072.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI 1640 Culture Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>L6529</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30396.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Mouse Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>011-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Pharmingen</td>
<td>553141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Anti-Mouse IgG3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Pharmingen</td>
<td>553401</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

induction and assessment of class switch recombination in purified murine b cells

L&#39;immunità umorale è il ramo del sistema immunitario mantenuto da parte delle cellule B e mediato attraverso la secrezione di anticorpi. Dopo l&#39;attivazione delle cellule B, il locus immunoglobuline subisce una serie di modificazioni genetiche per alterare la capacità di legame e le funzioni effettrici degli anticorpi secreti. Questo processo è evidenziato da un evento di ricombinazione genomica noto come ricombinazione di classe switch (CSR) in cui viene sostituito il valore predefinito di anticorpi IgM isotipo per una delle IgG, IgA o IgE. Ogni isotipo possiede diverse funzioni effettrici rendendo in tal modo la RSI fondamentale per il mantenimento dell&#39;immunità. Diversificazione del locus immunoglobuline è mediato dalla attivazione degli enzimi deaminasi indotta citidina (AID). Un video che descrive schematicamente questo processo in dettaglio è disponibile online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). Attività AID e la via della RSI sono comunemente studiate nella valutazione della funzione delle cellule B e immunità umorale nei topi. Il protocollo descritto in questo rapporto presenta un metodo di isolamento delle cellule B da milza murina e conseguente stimolazione con lipopolisaccaride batterico (LPS) per indurre il passaggio a classe IgG3 (per isotipi anticorpali altri vedi Tabella 1). Inoltre, la colorazione della cellula colorante fluorescente Carboxyfluorescein succinimidile estere (CFSE) è usato per controllare la divisione cellulare delle cellule stimolate, un processo cruciale per il passaggio isotipo 1, 2. La regolamentazione degli aiuti e il meccanismo con cui la RSI si sono ancora poco chiari, e quindi test in classe interruttore in vitro forniscono un metodo affidabile per testare questi processi in diversi modelli murini. Questi test sono stati utilizzati in precedenza nel contesto di carenza di gene utilizzando topi knockout 3. Inoltre, in vitro il passaggio delle cellule B può essere preceduto da trasduzione virale di modulare l&#39;espressione genica attraverso knockdown RNA o espressione del transgene 4-6. I dati da questi tipi di esperimenti hanno influenzato la nostra comprensione della attività AID, la risoluzione della reazione della RSI, e di anticorpi-mediata nel topo.

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Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

A seguito di esposizione agli antigeni, sottopopolazioni di cellule B attivate subire un processo noto come ricombinazione interruttore classe (CSR) per la produzione di anticorpi isotipi con distinte funzioni effettrici. Il protocollo descritto in questo rapporto spiega come la RSI può essere indotta e analizzati<em&gt; In vitro</em&gt; Al fine di studiare la funzione delle cellule B.

Induzione e Valutazione della ricombinazione Classe Switch in depurata cellule B murini

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Ricerca

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L&#39;identificazione del DNA Mutazioni in depurata ematopoietiche cellule staminali / progenitrici

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

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Rilevazione di True IgE-esprimono mouse B Cells Lineage

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