Name: induction and assessment of class switch recombination in purified murine b cells
Uploaded: 2010-08-13T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells at JoVE.com

Vi är tacksamma mot Martin laboratorium för hjälp diskussioner. Denna publikation stöds av ett stipendium från kanadensiska Institute of Health Research (MOP-89.783). AM stöds av en Canada Research Chair Tier II Award.

Steg I: Isolering av mjälten B-celler genom magnetisk anrikning <ol><li> Experimentell möss bör vara i åldern 8-12 veckor för att säkerställa full mognad av immunsystemet. </li><li> Euthanize musen genom halsdislokation och njuta i 70% etanol. Kirurgiskt ta bort mjälten genom att göra ett snitt genom huden och musklerna i vänster hypochondrium av buken och skär den i tre stora bitar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Se till att alla verktyg och reagens är sterila. </li><li> Med hjälp av gummi slutet av ...

<ol>
	<li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number.">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li><li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes.">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li><li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination.">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li><li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells.">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li><li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation.">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li><li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNF8/RNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination.">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li><li>Zaheen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+constrains+germinal+center+size+by+rendering+B+cells+susceptible+to+apoptosis.">AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis.</a> Blood. 114, 547-554 (2009).</li><li>Chaudhuri, J., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class-switch+recombination:+interplay+of+transcription,+DNA+deamination+and+DNA+repair.">Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair.</a> Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).</li><li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli+that+enhance+IgA+class+switching+increase+histone+3+acetylation+at+S+alpha,+but+poorly+stimulate+sequential+switching+from+IgG2b.">Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b.</a> Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).</li><li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+class+switching+differs+among+SJL,+C57BL/6+and+129+mice.">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li></ol>

Det protokoll som beskrivs ovan ger en standard test att bedöma statligt stöd uttryck och funktion under den klassen byte av primär murina B-celler. Detta protokoll använder bakteriella LPS att få byta från IgM till IgG3, även ändringar av stimulering media kan göras för att få byta till andra isotyper (sammanfattas i tabell 1 8, 9). Vi har noterat att för ännu okända skäl kan fetalt kalvserum påverka nivån på klassen byter observerats in vitro. Det är avgörand...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemcell Technologies</td>
<td>19754</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Falcon</td>
<td>352058</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C34554</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30072.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI 1640 Culture Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>L6529</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30396.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Mouse Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>011-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Pharmingen</td>
<td>553141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Anti-Mouse IgG3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Pharmingen</td>
<td>553401</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

induction and assessment of class switch recombination in purified murine b cells

Humorala immuniteten är den gren av immunsystemet upprätthålls av B-celler och förmedlade genom utsöndringen av antikroppar. Vid B-celler aktiveras genomgår immunglobulin lokus en serie av genetiska modifieringar för att ändra bindande kapacitet och effektor funktion utsöndras antikroppar. Denna process är markerad med en genomisk rekombination händelse kallas klass växla rekombination (CSR) som standard IgM-antikroppar isotyp ersätter en av IgG, IgA eller IgE. Varje isotyp besitter olika effektorfunktioner vilket gör CSR viktigt att upprätthålla immuniteten. Diversifiering av immunglobulin locus medieras av enzymet aktivering-inducerad cytidindeaminas (AID). En schematisk video som beskriver denna process i detalj finns på nätet (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID: s verksamhet och CSR-väg ofta studeras i bedömningen av B-cellernas funktion och humorala immuniteten hos möss. Det protokoll som beskrivs i denna rapport presenterar en metod för B-celler isolerade från murina mjälte och efterföljande stimulering med bakteriell lipopolysackarid (LPS) för att förmå klass byta till IgG3 (för andra antikroppar isotyper se tabell 1). Dessutom är den fluorescerande cellfärgning färg Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) används för att övervaka celldelning av stimulering av celler, en process avgörande för isotyp byta 1, 2. Regleringen av AID och mekanism genom vilken CSR förekommer fortfarande är oklara och därmed in vitro klassen växla ge en tillförlitlig metod för att testa dessa processer i olika musmodeller. Dessa analyser har tidigare använts i samband med genen brist med knockoutmöss 3. Dessutom kan in vitro-byte av B-celler att föregås av viral transduktion att modulera genuttrycket RNA ÖVERVÄLDIGANDE eller transgenen uttryck 4-6. Uppgifterna från dessa typer av experiment har påverkat vår förståelse av AID aktivitet, upplösning av CSR reaktion och antikroppsmedierat immunitet i musen.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells at JoVE.com

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Efter antigen exponering subpopulationer av aktiverade B-celler genomgå en process som kallas klass växla rekombination (CSR) för att producera antikroppar isotyper med distinkta effektorfunktioner. Det protokoll som beskrivs i denna rapport förklarar hur CSR kan induceras och analyseras<em&gt; In vitro</em&gt; För att studera B-cellernas funktion.

Induktion och Bedömning av klass Switch rekombination i Renad mus B-celler

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murina Modell av CD40-aktivering av B-celler

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Identifiera DNA Mutationer i renat Hematopoietic Stem / progenitorceller

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Upptäckt av True IgE-uttryck Mus B-celler

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion av murina tarminflammation med adoptiv överföring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hög</sup&gt; T-celler i möss med immunbrist

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Bedömning av immunmodulerande egenskaper av humana mesenkymala stamceller (MSC: er)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

En musmodell av grupp B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flödescytometrisk analys av partikelbundna Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

Genome-wide analys av HDAC-hämmare-medierad modulering av mikroRNA och mRNA i B celler förmås att genomgå klass-switch DNA-rekombination och Plasma celldifferentiering

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

In Vitro och In Vivo bedömning av T, B och myeloida celler suppressiv aktivitet och humorala svar från transplantation mottagare

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analys av skjuvning flöde-inducerad Migration av murin marginella zon B-celler In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...