Name: gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties
Uploaded: 2010-10-13T10:00:00
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Wir danken Michael J. Bruno, Radda Rusinova und Jon T. Sack für viele anregende Diskussionen. Finanzielle Unterstützung von NIH, R01GM021342 und ARRA ergänzen R01GM021342-35S1 und die Josiah Macy, Jr. Foundation OSA, die Tri-I CMB-Programm für HII, und die Iris L. und Leverett S. Woodworth Medical Scientist Fellowship und NIH MSTP gewähren GM07739 für RK.

1. Generieren Sie ANTS gefüllte Liposomen <ol><li> Am Tag 1, entfernen organische Lösungsmittel aus Lipiden. </li><li> Entfernen Lipid aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es auf Raumtemperatur äquilibriert. </li><li> Fügen Sie 0,6 ml 25 mg / mL (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) Lipid in Chloroform-Lösung in einen 25 mL Rundkolben. </li><li> Ständig drehen der Flasche während der Trocknung unter Stickstoff, bis alle das Chloroform verdampft ist und eine dünne weiße Lipidfilm bedeckt die gesamte unte...

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	<li>Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+through+simple+membranes.">Ion transport through simple membranes.</a> Renal Function. , (1978).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+thickness+and+membrane+protein+function:+An+energetic+perspective.">Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gramicidin+channels.+Versatile+tools.">Gramicidin channels. Versatile tools.</a> Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).</li><li>Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+functions+for+the+analysis+of+luminescence+decays+with+underlying+distributions+1.+Kohlrausch+decay+function+(stretched+exponential.">Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential.</a> Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).</li><li>Bruggemann, E. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+optimum+lipophilicity+and+molecular+weight+ranges+for+drug+candidates-Molecular+weight+dependent+lower+logD+limits+based+on+permeability.">Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).</li></ol>

Wir haben eine schnelle Fluoreszenz-basierter Assay für die Bestimmung der Doppelschicht Änderung Potential von Medikamenten und anderen kleinen Amphiphile demonstriert. Verbindungen, die Doppelschicht Eigenschaften zu verändern dürften membrane protein-Funktion in eine indirekte, unspezifische Art und Weise verändern, möglicherweise einen Beitrag zur &quot;off-target&quot; Arzneimittelwirkungen. Der Test nutzt die Leistung von Gramicidin Kanäle als Sonden für die Veränderungen in Doppelschicht Eigenschaften <s...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

Viele Medikamente und andere kleine Moleküle zur Modulation biologischen Funktion sind Amphiphile, die Adsorption an der Doppelschicht / Lösung-Grenzfläche und damit Lipiddoppelschicht Eigenschaften zu verändern. Dies ist wichtig, weil Membranproteine ​​energisch an ihre Host-Doppelschicht durch hydrophobe Wechselwirkungen gekoppelt. Änderungen in Doppelschicht Eigenschaften verändern somit membrane protein-Funktion, die einen indirekten Weg für Amphiphile modulieren Protein-Funktion und einen möglichen Mechanismus für &quot;off-target&quot; Arzneimittelwirkungen zu Verfügung stellt. Wir haben bereits eine elektrophysiologische Assay zum Nachweis von Veränderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften mittels linearer Gramicidin Kanäle als Sonden 3,12 entwickelt. Gramicidin-Kanäle sind Mini-Proteine ​​durch die Transbilayer Dimerisierung von zwei nicht-leitenden Untereinheiten gebildet. Sie reagieren empfindlich auf Veränderungen in ihrer Membran-Umgebung, die ihnen leistungsfähige Sonden zur Überwachung von Veränderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften wie spürte durch Doppelschicht Spanning Proteine ​​macht. Wir zeigen jetzt, ein Fluoreszenz-Assay zum Nachweis von Veränderungen in Doppelschicht Eigenschaften mit den gleichen Kanälen wie Sonden. Der Test basiert auf der Messung der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzlöschung von Fluorophor-geladen große unilamellare Vesikel durch die Eingabe einer Quencher durch die Gramicidin-Kanäle auf. Wir nutzen die Fluoreszenz-Anzeige / Quencher-Paar 8-Aminonaphthalin-1 ,3,6-trisulfonat (ANTS) / Tl. +, Mit der bereits in anderen Fluoreszenzlöschung Assays 5,13 verwendet Tl + durchdringt die Lipid-Doppelschicht langsam 8, sondern geht leicht durch die Durchführung Gramicidin Kanäle 1,14. Die Methode ist skalierbar und eignet sich sowohl für mechanistische Studien-und High-Throughput-Screening von kleinen Molekülen für Doppelschicht-stören, und das Potenzial &quot;off-target&quot;, Effekte. Wir finden, dass die Ergebnisse mit dieser Methode in guter Übereinstimmung mit früheren elektrophysiologischen Ergebnisse 12 sind.

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Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Wir stellen Ihnen eine schnelle Fluoreszenz-basierter Assay, dass die Rate der Fluoreszenzlöschung als Maß für Gramicidin-Kanal-Aktivität überwacht. Die Gramicidin Kanäle sind als molekulare Kraftaufnehmer verwendet, um Änderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften wie spürte durch Doppelschicht Spanning Proteine ​​zu überwachen.

Gramicidin-basierte Fluoreszenz-Assay; zur Bestimmung Small Molecules Potential für das Ändern von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Research

JoVE Journal

Biology

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Die Anwendung eines C. elegans Dopamin Neuron Degeneration Assay für die Validierung von potenziellen Parkinson Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Forschung

Biologie

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Verfahren für die Ratte<em&gt; In situ</em&gt; Skeletal Muscle kontraktilen Eigenschaften

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Substrat Generation für Endonukleasen der CRISPR / Cas-Systeme

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

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Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Angebundene Doppelschicht-Lipidmembranen zur Überwachung der Wärmeübertragung zwischen Goldnanopartikeln und Lipidmembranen

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...