Name: gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties
Uploaded: 2010-10-13T10:00:00
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我々は、多くの刺激的な議論のためにマイケルJ.ブルーノ、ラッダRusinovaとジョンT.サックに感謝。 NIH、R01GM021342とARRAサプリメントR01GM021342 - 35S1、及びOSAのジョサイアメイシー、ジュニア財団からの財政支援、トライ- I HII用CMBプログラム、およびアイリスL.とレヴェレットS.ウッドワース医学者フェローシップとNIH MSTP助成金RK用GM07739。

1。 ANTS充填リポソームを生成する<ol><li> 1日目に、脂質から有機溶媒を除去。 </li><li>冷凍庫から脂質を取り外して、常温に平衡させる。 </li><li> 25mLの丸底フラスコにクロロホルム溶液25 mg / mLの（1,2 - dierucoyl - sn -グリセロ-3 - ホスホコリン）脂質0.6 mLを加え。 </li><li>すべてのクロロホルムが蒸発し、脂質コートフラスコの全体の下半分の薄い白色フィルム完了するまで、窒素下で乾燥しなが...

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	<li>Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+through+simple+membranes.">Ion transport through simple membranes.</a> Renal Function. , (1978).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+thickness+and+membrane+protein+function:+An+energetic+perspective.">Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gramicidin+channels.+Versatile+tools.">Gramicidin channels. Versatile tools.</a> Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).</li><li>Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+functions+for+the+analysis+of+luminescence+decays+with+underlying+distributions+1.+Kohlrausch+decay+function+(stretched+exponential.">Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential.</a> Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).</li><li>Bruggemann, E. P., Kayalar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+molecularity+of+the+colicin+E1+channel+by+stopped-flow+ion+flux+kinetics.">Determination of the molecularity of the colicin E1 channel by stopped-flow ion flux kinetics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4273-4276 (1986).</li><li>Bruno, M. J., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid+alters+bilayer+elastic+properties.">Docosahexaenoic acid alters bilayer elastic properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 9638-9643 (2007).</li><li>Buboltz, J. T., Feigenson, G. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+is+a+modulator+of+bilayer+material+properties.">Curcumin is a modulator of bilayer material properties.</a> Biochemistry. 46, 10384-10391 (2007).</li><li>Keser&#252;, G. M., Makara, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+lead+discovery+strategies+on+the+properties+of+drug+candidates.">The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).</li><li>Leeson, P. D., Springthorpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+drug-like+concepts+on+decision-making+in+medicinal+chemistry.">The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 6, 881-890 (2007).</li><li>Lundb k, J. A., Collingwood, S. A., Ing&#243;lfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S., S, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+regulation+of+membrane+protein+function:+gramicidin+channels+as+molecular+force+probes.">Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes.</a> J. R. Soc. Interface. 7, 373-395 (2010).</li><li>Moore, H. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Raftery, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+gramicidin+channel+formation+in+lipid+bilayers:+transmembrane+monomer+association.">Kinetics of gramicidin channel formation in lipid bilayers: transmembrane monomer association.</a> Science. 250, 1256-1259 (1990).</li><li>S&#248;gaard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+function+is+regulated+by+lipid+bilayer+elasticity.">GABAA receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity.</a> Biochemistry. 45, 13118-13129 (2006).</li><li>Waring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+optimum+lipophilicity+and+molecular+weight+ranges+for+drug+candidates-Molecular+weight+dependent+lower+logD+limits+based+on+permeability.">Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).</li></ol>

私たちは、麻薬や他の小さな両親媒性物質の二重層変更の可能性を決定するための高速な蛍光ベースのアッセイを実証している。二重層のプロパティを変更する化合物は、おそらく&quot;オフターゲット&quot;薬の効果に​​貢献し、間接的、非特異的に膜タンパク質の機能を変更する可能性があります。アッセイは、二重層貫通タンパク質によって感知される二層プロパティの変更12の...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

多くの薬と生物学的機能を調節するために使用される他の小さな分子は両親媒性脂質二重層/溶液界面のその吸着であり、それによって脂質二重層のプロパティを変更する。膜タンパク質がエネルギー的に疎水性相互作用によって、そのホストの二重層に結合されているため、これは重要です。二重層の特性の変化は、このように両親媒性物質は、タンパク質の機能と&quot;オフターゲット&quot;薬の効果の可能なメカニズムを変調するための間接的な方法を提供する、膜タンパク質の機能を変化させる。我々は以前のプローブ3,12のような線形グラミシジンのチャンネルを使用して、脂質二重層の特性の変化を検出するための電気生理学的ア ​​ッセイを開発した。グラミシジンのチャンネルは2つの非導電性サブユニットのtransbilayer二量体化によって形成されるミニ蛋​​白質である。彼らはそれらのタンパク質にまたがる二重層により検知されたとして、脂質二重層の特性の変化を監視するための強力なプローブになる彼らの膜環境の変化に敏感です。我々は現在、プローブと同じチャンネルを使用して二重層の特性の変化を検出するための蛍光アッセイを示す。アッセイは、グラミシジンのチャンネルを通じて、クエンチャーのエントリに起因する蛍光体にロードされた大きな単ラメラ小胞からの蛍光消光の時間経過を測定することに基づいています。我々は、蛍光指示薬/消光剤ペア8 -アミノナフタレン-1,3,6 - trisulfonate（ANTS）/ TL +を正常他の蛍光消光アッセイ5,13で使用されている使用してください。 TL +はゆっくり8脂質二重層に浸透がグラミシジンのチャンネル1,14を実施を通じて容易に通過する。このメソッドは、両方の効果機序の研究と二重層-摂動のための小分子のハイスループットスクリーニング、および潜在的な&quot;オフターゲット&quot;のための拡張性と最適です。我々は、このメソッドを使用して結果が以前の電気生理学的結果12とよく一致していることがわかります。

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Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

我々は、グラミシジンチャネル活性の尺度としての蛍光消光の速度を監視し、高速蛍光ベースのアッセイをご紹介。グラミシジンのチャンネルは、タンパク質にまたがる二重層により検知されたとして、脂質二重層の特性の変化を監視するための分子力変換器として使用されています。

グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Research

JoVE Journal

Biology

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

二層弾性特性の変化をモニタリングするための単一分子法

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

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酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

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ラットのための手順<em&gt;その場で</em&gt;骨格筋収縮特性

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / CASシステムの酵素のための基質の生成

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

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ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

金ナノ粒子と脂質膜の熱伝達をモニターする二重層脂質膜

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...