Name: gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties
Uploaded: 2010-10-13T10:00:00
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Agradecemos a Michael J. Bruno, Radda Rusinova e Jon T. Sack para muitas discussões estimulantes. Apoio financeiro do NIH, R01GM021342 e complementar ARRA R01GM021342-35S1, ea Josiah Macy, Jr. da Fundação para a SAOS, o Tri-I programa CMB para HII, e L. A Iris e Leverett S. Woodworth Medical Fellowship Scientist e NIH MSTP conceder GM07739 para RK.

1. Gerar ANTS cheio de Lipossomas <ol><li> No dia 1, remover solvente orgânico a partir de lipídios. </li><li> Retire do freezer de lipídios e deixá-lo atingir a temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 0,6 mL de 25 mg / mL (1,2-dierucoyl-sn-glicero-3-fosfocolina) lipídico em clorofórmica solução para um balão de fundo 25 mL rodada. </li><li> Continuamente girar o frasco durante a secagem em nitrogênio, até que todos os clorofórmio tenha evaporado e uma fina película branca de camadas lipídicas toda a m...

<ol>
	<li>Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+through+simple+membranes.">Ion transport through simple membranes.</a> Renal Function. , (1978).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+thickness+and+membrane+protein+function:+An+energetic+perspective.">Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gramicidin+channels.+Versatile+tools.">Gramicidin channels. Versatile tools.</a> Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).</li><li>Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+functions+for+the+analysis+of+luminescence+decays+with+underlying+distributions+1.+Kohlrausch+decay+function+(stretched+exponential.">Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential.</a> Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).</li><li>Bruggemann, E. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+optimum+lipophilicity+and+molecular+weight+ranges+for+drug+candidates-Molecular+weight+dependent+lower+logD+limits+based+on+permeability.">Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).</li></ol>

Nós demonstramos um ensaio de fluorescência baseada rápido para determinar o potencial de modificar bicamada de drogas e outros anfifílicos de pequeno porte. Compostos que modificam propriedades bicamada são susceptíveis de alterar a função da membrana de proteína de uma maneira indireta inespecífica, possivelmente contribuindo para &quot;fora do alvo&quot; efeitos de drogas. O ensaio explora o poder dos canais de gramicidin como sondas para mudanças nas propriedades bicamada 12 que são sentidos p...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

Muitas drogas e outras moléculas pequenas usadas para modular a função biológica são anfifílicos que adsorvem na interface bicamada / solução e, assim, alterar as propriedades de bicamada lipídica. Isto é importante porque as proteínas da membrana são energeticamente acoplado a sua bicamada acolhimento por interações hidrofóbicas. Alterações nas propriedades bicamada, assim, alterar a função da membrana de proteína, que fornece uma maneira indireta de anfifílicos para modular a função das proteínas e um possível mecanismo para &quot;fora do alvo&quot; efeitos de drogas. Nós já desenvolveram um ensaio para a detecção de alterações eletrofisiológicas nas propriedades bicamada lipídica utilizando canais gramicidin linear como sondas 3,12. Canais gramicidina são mini-proteínas formadas pela dimerização transbilayer de duas subunidades não-condutor. Eles são sensíveis a mudanças em seu ambiente de membrana, o que os torna sondas poderosa para acompanhamento da evolução das propriedades bicamada lipídica como sentiu por proteínas bicamada de expansão. Nós agora demonstrar um ensaio de fluorescência para a detecção de alterações nas propriedades bicamada utilizando os mesmos canais como sondas. O ensaio é baseado na medição do tempo de percurso de extinção de fluorescência de fluoróforo-carregado vesículas unilamelares grandes devido à entrada de um supressor através dos canais gramicidin. Usamos o par indicador / supressor de fluorescência 8-aminonaftaleno-1 ,3,6-trisulfonate (ANTS) / Tl + que tem sido utilizado com sucesso em outros ensaios extinção de fluorescência 5,13. Tl + permeia a bicamada lipídica lentamente 8, mas passa facilmente através da realização de canais gramicidin 1,14. O método é escalável e adequado tanto para estudos mecanísticos e high-throughput screening de moléculas pequenas para bicamada perturbando, e potencial &quot;fora do alvo&quot;, os efeitos. Nós achamos que os resultados obtidos utilizando este método estão em boa concordância com resultados anteriores eletrofisiológicas 12.

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Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Nós introduzimos um ensaio de fluorescência baseada rápido que monitora a taxa de extinção de fluorescência como uma medida da atividade do canal gramicidin. Os canais gramicidin são usados ​​como transdutores de força molecular para monitorar as mudanças nas propriedades bicamada lipídica como sentiu por proteínas bicamada de expansão.

Gramicidina baseado em Ensaio de fluorescência; para determinar Moléculas Pequenas Potencial para Modificação de Propriedades bicamada lipídica

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Research

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Biology

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

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Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

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Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Métodos única molécula para acompanhar as alterações nas propriedades elásticas bicamada

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Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

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