Name: gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties
Uploaded: 2010-10-13T10:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties at JoVE.com

Vi tackar Michael J. Bruno, Radda Rusinova och Jon T. Sack för många stimulerande diskussioner. Ekonomiskt stöd från NIH, R01GM021342 och Arra komplettera R01GM021342-35S1, och Josiah Macy, Jr Foundation att OSA, Tri-Jag CMB program för HII och Iris L. och Leverett S. Woodworth Medicinsk Forskare Gemenskap och NIH MSTP bevilja GM07739 för RK.

1. Generera ANTS fyllda Liposomer <ol><li> Dag 1, ta bort organiska lösningsmedel från lipider. </li><li> Ta bort fett från frysen och låt den anta rumstemperatur. </li><li> Tillsätt 0,6 ml 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) lipid i kloroform lösning till en 25 ml rund botten kolv. </li><li> Ständigt rotera kolven medan torkningen under kväve, tills alla kloroform har avdunstat och en tunn vit hinna av fett rockar hela nedre halvan av kolven. </li><li> Torka i exsickator under vakuum över ...

<ol>
	<li>Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+through+simple+membranes.">Ion transport through simple membranes.</a> Renal Function. , (1978).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+thickness+and+membrane+protein+function:+An+energetic+perspective.">Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gramicidin+channels.+Versatile+tools.">Gramicidin channels. Versatile tools.</a> Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).</li><li>Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+functions+for+the+analysis+of+luminescence+decays+with+underlying+distributions+1.+Kohlrausch+decay+function+(stretched+exponential.">Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential.</a> Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).</li><li>Bruggemann, E. P., Kayalar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+molecularity+of+the+colicin+E1+channel+by+stopped-flow+ion+flux+kinetics.">Determination of the molecularity of the colicin E1 channel by stopped-flow ion flux kinetics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4273-4276 (1986).</li><li>Bruno, M. J., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid+alters+bilayer+elastic+properties.">Docosahexaenoic acid alters bilayer elastic properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 9638-9643 (2007).</li><li>Buboltz, J. T., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+the+preparation+of+liposomes:+rapid+solvent+exchange.">A novel strategy for the preparation of liposomes: rapid solvent exchange.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1417, 232-245 (1999).</li><li>Gutknecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadmium+&#38;+thallous+ion+permeabilities+through+lipid+bilayer+membranes.">Cadmium &#38; thallous ion permeabilities through lipid bilayer membranes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 735, 185-188 (1983).</li><li>Ing&#243;lfsson, H. I., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+is+a+modulator+of+bilayer+material+properties.">Curcumin is a modulator of bilayer material properties.</a> Biochemistry. 46, 10384-10391 (2007).</li><li>Keser&#252;, G. M., Makara, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+lead+discovery+strategies+on+the+properties+of+drug+candidates.">The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).</li><li>Leeson, P. D., Springthorpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+drug-like+concepts+on+decision-making+in+medicinal+chemistry.">The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 6, 881-890 (2007).</li><li>Lundb k, J. A., Collingwood, S. A., Ing&#243;lfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S., S, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+regulation+of+membrane+protein+function:+gramicidin+channels+as+molecular+force+probes.">Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes.</a> J. R. Soc. Interface. 7, 373-395 (2010).</li><li>Moore, H. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Raftery, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+spectroscopic+studies+of+cation+translocation+by+Torpedo+acetylcholine+receptor+on+a+time+scale+of+physiological+relevance.">Direct spectroscopic studies of cation translocation by Torpedo acetylcholine receptor on a time scale of physiological relevance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4509-4513 (1980).</li><li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+specificity+of+the+gramicidin+channel+and+the+thallous+ion.">Ionic specificity of the gramicidin channel and the thallous ion.</a> Biochim. Biophys. Acta. 401, 540-544 (1975).</li><li>O'Connell, A. M., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+gramicidin+channel+formation+in+lipid+bilayers:+transmembrane+monomer+association.">Kinetics of gramicidin channel formation in lipid bilayers: transmembrane monomer association.</a> Science. 250, 1256-1259 (1990).</li><li>S&#248;gaard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+function+is+regulated+by+lipid+bilayer+elasticity.">GABAA receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity.</a> Biochemistry. 45, 13118-13129 (2006).</li><li>Waring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+optimum+lipophilicity+and+molecular+weight+ranges+for+drug+candidates-Molecular+weight+dependent+lower+logD+limits+based+on+permeability.">Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).</li></ol>

Vi har visat en snabb fluorescens-baserad analys för fastställande av tvåskiktsmembran ändra potentialen av droger och andra små biomolekylära. Föreningar som modifierar tvåskiktsmembran egenskaper sannolikt att ändra funktion membranprotein på ett indirekt, ospecifik sätt kan bidra till en &quot;off-target&quot; läkemedelseffekter. Analysen utnyttjar kraften i gramicidin kanaler som sonder för förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter 12 som kände av tvåskiktsmembran-spänner proteiner. D...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

Många läkemedel och andra små molekyler som används för att modulera biologiska funktionen är biomolekylära som absorberar vid tvåskiktsmembran / lösningen gränssnitt och därmed ändra egenskaperna membranet. Detta är viktigt eftersom membranproteiner är energiskt kopplade till sin värd tvåskiktsmembran med hydrofoba interaktioner. Förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter förändrar därmed funktionen membran protein, som ger ett indirekt sätt för biomolekylära att modulera proteiners funktion och en möjlig mekanism för &quot;off-target&quot; läkemedelseffekter. Vi har tidigare utvecklat en elektrofysiologisk test för att upptäcka förändringar i membranet egenskaper med hjälp av linjär gramicidin kanaler som sonder 3,12. Gramicidin kanaler mini-proteiner som bildas av transbilayer dimerization av två icke-ledande subenheter. De är känsliga för förändringar i deras membran miljö, vilket gör dem kraftfulla sonder för övervakning av förändringar i fastigheter membranet som kände av tvåskiktsmembran spänner proteiner. Vi visar nu en fluorescens-test för att upptäcka förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter med samma kanaler som sonder. Analysen är baserad på mätning av tid loppet av fluorescens släcka från fluoroforen-loaded stora unilamellar blåsor på grund av införandet av en törstsläckare genom gramicidin kanaler. Vi använder fluorescerande indikator / quencher par 8-Aminonaftalen-1 ,3,6-trisulfonate (myror) / TL + som framgångsrikt har använts i andra fluorescens släcka analyser 5,13. Tl + genomsyrar membranet sakta 8, men går lätt föra en gramicidin kanaler 1,14. Metoden är skalbar och passar både mekanistiska studier och high-throughput screening av små molekyler för tvåskiktsmembran-störande, och möjligheter &quot;off-target&quot;, effekter. Vi finner att resultat med denna metod är väl överens med tidigare elektrofysiologiska resultat 12.

Watch this Scientific Journal Video about Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties at JoVE.com

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Vi inför en snabb fluorescens-baserad analys som övervakar graden av fluorescens släcka som ett mått på gramicidin kanal aktivitet. Den gramicidin kanaler används som molekylära kraftgivare att övervaka förändringar i membranet egenskaper som kände av tvåskiktsmembran spänner proteiner.

Gramicidin-baserade Fluorescens-analys, för fastställande av små molekyler Potential för modifiering av membranet Egenskaper

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Research

JoVE Journal

Biology

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Tillämpning av en C. elegans Dopamin Neuron Degeneration-analys för validering av potentiella Parkinsons sjukdomsgener

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Enda molekyl Metoder för att följa förändringar i tvåskiktsmembran elastiska egenskaper

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

En fluorescensmikroskopi-analys för övervakning Mitophagy i jästen Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Förfaranden för råtta<em&gt; In situ</em&gt; Skelettmuskulaturen Kontraktila egenskaper

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Substrat för skapandet endonukleaser av CRISPR / CAS Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Mycket effektiv Ligering av små RNA-molekyler för MicroRNA Kvantifiering av hög genomströmning sekvense

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Bestämma membranprotein Topologi Använda Fluorescens Proteas Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferas komplettering Imaging test i Nicotiana benthamiana blad för övergående bestämma Protein-protein interaktioner Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Tjudrade Bilayer Lipidmembran för att övervaka värmeöverföring mellan guldnanopartiklar och lipidmembran

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...