Name: single cell transfection in chick embryos
Uploaded: 2010-09-25T17:00:00
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Ringraziamo Shlomi Krispin per l&#39;immagine del tubo neurale. In particolare, noi riconosciamo Yuval Cannella per l&#39;avvio della tecnica di transfezione GFP. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti la Israel Science Foundation, Association Francaise contre les Myopathies e Forschungsgemeinshaft Deutsche, Centro di Ricerca in collaborazione da 488 a CK

1. Preparazione del Micropipette Tiriamo le nostre pipette su un Narishige standard di pp-83 pipetta estrattore con una regolazione di calore di 13,5. La regolazione precisa deve essere calibrato, mirando ad un diametro di punta della pipetta tra gli 8 ei 10 micron. Noi usiamo filamento contenenti tubi in vetro borosilicato con un diametro esterno di 1,0 mm e diametro interno 0,75-0,78 mm. Le pipette sono quindi memorizzati in un piatto di plastica con le punte protetto dal contatto con i bord...

<ol>
	<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates.">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium,+smooth,+and+striated+muscle.">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li><li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+.">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. .</a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos.">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li></ol>

Il metodo descritto sopra è una modifica di una tecnica descritta in precedenza per la consegna di coloranti lipofilici a sottoinsiemi di cellule piccole o progenitori singolo 3. Ha tre vantaggi principali rispetto alla tecnica standard di elettroporazione. In primo luogo, fornisce un mezzo per l&#39;etichettatura con siti discreta fiducia nei tessuti bersaglio, consentendo maggiore risoluzione spaziale di elettroporazione (vedi ad esempio Figura 1B, C). In secondo luogo, permette l&#39;etichettatura delle s...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pipette tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>B100-75-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>2-000-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insect needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Watkins &amp; Doncaster</td>
<td>E6871</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>03-031-1B</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

single cell transfection in chick embryos

Un tema centrale in biologia dello sviluppo è la diversificazione delle linee e la delucidazione dei meccanismi molecolari alla base. Ciò comporta un&#39;analisi approfondita dei destini di singole cellule in condizioni normali e sperimentali. A tal fine, i metodi di trasfezione che l&#39;obiettivo progenitori singole sono un prerequisito. Descriviamo qui un metodo tecnicamente semplice per trasfezione singole cellule nei tessuti pollo in-ovo, permettendo lignaggio tracciamento affidabile così come la manipolazione genetica. Domini tessuto specifici sono mirati all&#39;interno del somite o tubo neurale, e il DNA è iniettato direttamente nel epitelio di interesse, con conseguente trasfezione sporadici di singole cellule. Utilizzando i giornalisti, le popolazioni clonale può quindi essere fatta per un massimo di tre giorni, e il comportamento delle popolazioni geneticamente manipolati clonale può essere paragonata a quella dei controlli. Questo metodo sfrutta l&#39;accessibilità del embrione di pollo con strumenti emergenti per la manipolazione genetica. Noi confrontare e discutere i vantaggi rispetto al metodo ampiamente utilizzato elettroporazione, e le possibili applicazioni e l&#39;uso in ulteriori in-vivo i modelli sono inoltre suggerito. Noi sosteniamo l&#39;utilizzo di questo metodo come un&#39;aggiunta significativa e complemento per lignaggio tracciamento e gli strumenti esistenti interferenze genetiche.

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Single Cell Transfection in Chick Embryos

Utilizzando punta fine micropipette iniettiamo DNA plasmidico in sottodomini di somiti pollo o tubi neurali. La concentrazione del plasmide è regolata per generare solo cellule transfettate. Abbiamo poi permettere alle cellule di trasformarsi in popolazioni clonale.

Cella Transfection singola in embrioni di pollo

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Dissezione di 6,5 embrioni di topo dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Ricerca

Biologia

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

In Electroporations Ovo della Fase HH 10 embrioni di pollo

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Unicellulari registrazioni di aspirazione da Fotorecettori Cone mouse

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...