Name: electroeluting dna fragments
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroeluting DNA Fragments at JoVE.com

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد تم تمويل العمل في المختبر من قبل الدكتور برموديز CONACYT (المنحة # 82622) ، ونشكر غابرييلا جوتيريز ، سوسا ، Eliuth رييس - مارتينيز ورودريغيز زيمينا توريس لتسجيل الفيديو الإجراء electroleution. </p>

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل اختيار شظايا من الحمض النووي التي تهم يمكن تنقيته ، ينبغي حل هذه agarose في المواد الهلامية أو هلام ملون الأكريلاميد مع بروميد إيثيديوم بواسطة الكهربائي باستخدام العازلة 0.5X TBE (تريس بورات ، EDTA) عند 120 فولت لمدة 1 ساعة. وقد استخدم لهذا ، ~ 700 نانوغرام من البلازميد pProEx GdMre11S - (6000 - BP) هضمها من قبل مع وNdeI HindIII على الافراج عن 900 قطعة من الغليان (560 نانوغرام من البلازميد و 84 نانوغرام في جزء منه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن تملأ خزان electroeluter (الشكل 1) مع 0.5X TBE موزعة بالتساوي في كل جانب من الهضبة منتصف رعاية لا صرفها على هضبة متوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع الشريط المحدد (أو نطاقات) للخروج من هلام ، وتوضع في حجرة العينة أقرب وقت ممكن إلى القناة الخامسة (شريحة واحدة لكل بئر). وينبغي أن يضاف إلى المخزن تشغيل كل غرفة ، ما يكفي لتغطية شريحة هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم مسح كل قناة V استخدامها مع ماصة باستور للقضاء على أي فقاعة الهواء المحبوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تضاف برفق 100 من المجاهدين 10 M خلات NH <sub>4</sub> (لتسهيل التصور يتم إضافة كمية صغيرة من اللون الأزرق bromophenol ، وهو ما يكفي فقط لأنه لون) داخل القناة الخامس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب إغلاق الغطاء برفق لمنع أي إعادة تعليق من الملح وسادة عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبدأت في Electroelution 100 فولت لمدة 25 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال electrolution ، تتم إزالة 400 من المجاهدين V - القناة ، ووضعها في أنبوب microfuge أن تكون عجلت مع 2 مجلدات من الايثانول الباردة والجليكوجين (مستحسن لتحسين استرداد DNA) في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة أو بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة ، ويغسل إزالة طاف مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الجافة وتحديد الحمض النووي في 260 نانومتر OD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكان الانتعاش الحصول على 75 ٪ (63 نانوغرام تعافى عندما وضعت 84 نانوغرام في قناة V -). </li></ol><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="الشكل 1" /><br /> <strong>الشكل 1.</strong> Electroeluter الرسم التخطيطي. واشارت الى أنود الكاثود على كل جانب من الحمض النووي ، خزان الواردة في جل شرائح (كما هو موضح مربع أسود) سوف تهاجر نحو الكاثود بسبب شحنتها السالبة. ثم سيتم المحاصرين في وسادة الملح (ممثلة مثلث مقلوب سوداء) الموجود في V - القناة. </p>

<ol>
	<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Cloning: A Laboratory Manual</em>. , (1989).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> ومدة تشغيل تعتمد بشكل كبير على حجم الشظايا ، شظايا عادة لمدة تصل إلى 20 كيلو بايت 50 دقيقة إلى 1 ساعة ويكفي ، في حين أن أجزاء صغيرة مطلوب ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمتابعة كل 10 دقائق لمنع شظية من خلال الذهاب الى وسادة الملح وبالتالي الى الغرفة العازلة مصعدي انخفاض الانتعاش. فمن المهم للتأكد من أنه عند تعيين إمدادات الطاقة الخاص في 100 فولت ، وهناك ما لا يقل عن mAmp الحالية من 10. يمكن رصد الفرقة الحمض النووي باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية من ناحية وكشف هذا عندما يتخلى عن شريحة هلام. يمكن أيضا أن تكون وسادة الملح مع 3 خلات نا م. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> هذا الإجراء يسمح radiolabeled تنقية شظايا الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من أحجام مختلفة مع انتعاش جيدة (~ 80 ٪) ، هضمها بواسطة إنزيمات التقييد ، التي تتم معالجتها بواسطة الانزيمات تعديل ، إلخ. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NdeI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>R0111L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HindIII</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>R0104L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NH<sub>4</sub> acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>JTBaker</td>
<td>0596</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>6131 000 020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroeluter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>IBI</td>
<td>UEA CAT 46000</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

electroeluting dna fragments

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم شظايا من الحمض النووي لأغراض مختلفة المنقى في البيولوجيا الجزيئية ، ويمكن أن يكونوا مستعدين من خلال إجراءات عدة. معظمها تتطلب الكهربائي السابقة للشظايا من الحمض النووي من أجل فصل عصابة من الفائدة. ثم ، يتم رفعه من هذه الفرقة من agarose هلام أو الأكريلاميد وتنقيتها باستخدام إما : ملزمة وشطف الزجاج أو من جزيئات السيليكا ، والأغشية ثنائي إيثيل أمينو إيثيل السليلوز ، &quot;سحق ونقع الأسلوب&quot; ، electroelution أو في كثير من الأحيان مكلفة تنقية مجموعات تجارية. وبالتالي ، فإن اختيار الأسلوب يعتمد في الغالب على ما يتوفر في المختبر. الإجراء electroelution يسمح احد لتنقية الحمض النووي نظيفة جدا لاستخدامها في عدد كبير من التطبيقات (التسلسل ، radiolabeling ، وتقييد الأنزيمية ، وتعديل الأنزيمية ، الخ الاستنساخ). يتكون هذا الإجراء في وضع الحمض النووي الفرقة التي تحتوي على مادة الأكريلاميد agarose أو شرائح داخل الآبار عينة من electroeluter ، ثم تطبيق الحالية سيجعل جزء الحمض النووي لمغادرة agarose وبالتالي يكون محاصرا في وسادة الملح التي سيتم استردادها في وقت لاحق عن طريق الترسيب الايثانول. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Electroeluting DNA Fragments at JoVE.com

Electroeluting DNA Fragments

<p class="jove_content">هذا الإجراء يسمح للتنقية مع شظايا الحمض النووي عالية الغلة.</p>

Electroeluting شظايا الحمض النووي

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methylated DNA Immunoprecipitation

ميثليته الحمض النووي مناعي

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA - النظائر المستقرة جس (DNA - SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

جيل من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي DNA في الجينوم الهجائن التي تحول باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على [أليغنوكليوتيد]

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

تصور تكرار الحمض النووي في DT40 النظام النموذجي الفقارية باستخدام تقنيات الحمض النووي الألياف

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

تكرارية الأمثل من دوبلكسات DNA لبلورة-DNA من SeqA مجمعات

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

إعداد crosslinked-DNA بولي أكريلاميد الهلاميات المائية

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

مظاهرة من بروتين تفعيل قناة الصوديوم الظهارية (عناق) من خلال الجمع بين المقاييس الحالية مع الكشف عن الشق شظايا

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...