Name: electroeluting dna fragments
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroeluting DNA Fragments at JoVE.com

<p class="jove_content"> Werk in Dr Bermudez laboratorium werd gefinancierd door Conacyt (Grant # 82622). Wij danken Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez en Ximena Rodriguez-Torres voor video-opname van de electroleution procedure. </p>

<ol><li> Met het oog op DNA-fragmenten van belang worden gezuiverd te selecteren, moeten deze worden opgelost in agarose gels of acrylamide gel gekleurd met ethidiumbromide door middel van elektroforese met 0.5X TBE buffer (Tris boraat, EDTA) bij 120 volt gedurende 1 uur. Voor deze, ~ 700 ng van het plasmide pProEx-GdMre11S (6000-bp) eerder verteerd met Ndel en HindIII werd gebruikt om een ​​900-bp fragment (560 ng van plasmide en 84 ng van het fragment) release. </li><li> De electroeluter tank (figuur 1) moet worden gevuld met 0.5X TBE gelijk verdeeld aan elke kant van het midden van de plateau de verzorging van niet morsen het op het midden van de plateau. </li><li> De geselecteerde band (of banden) wordt gesneden uit de gel, en geplaatst in monsterkamer zo dicht mogelijk bij de V-kanaal (een slice per putje). Running buffer moet worden toegevoegd aan elke kamer; net genoeg om de gel slice te dekken. </li><li> Elke gebruikte V kanaal moet worden gespoeld met een Pasteur pipet aan een ingesloten luchtbel te elimineren. </li><li> Dan 100 ul van 10 M NH <sub>4-acetaat</sub> (voor visualisatie te vergemakkelijken een kleine hoeveelheid broomfenolblauw is toegevoegd, net genoeg om het kleur) worden voorzichtig aan de binnenzijde van de V-kanaal. </li><li> Het deksel moet voorzichtig worden gesloten voor een resuspensie van de hoge zoute kussen te voorkomen. </li><li> Elektro is begonnen op 100 volt voor 25 minuten. </li><li> Wanneer electrolution is voltooid, worden 400 ul verwijderd van V-kanaal, en geplaatst in een microfugebuis te worden neergeslagen met twee volumes van de koude ethanol en glycogeen (aanbevolen om DNA herstel te verbeteren) bij 4 ° C gedurende 1 uur of &#39;s nachts. </li><li> Centrifugeer gedurende 20 minuten, verwijder supernatant en wassen met 70% ethanol. </li><li> Droge buis en te kwantificeren DNA bij OD 260 nm. </li><li> Verkregen Het herstel was 75% (63 ng hersteld toen 84 ng werden geplaatst op de V-kanaal). </li></ol><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="Figuur 1" /><br /> <strong>Figuur 1.</strong> Electroeluter diagram. Geanod een kathode worden aangegeven op elke kant van de tank, DNA in gel gesneden (geïllustreerd als een zwart vierkant) zal migreren naar de kathode als gevolg van de negatieve lading. Dan zal het gevangen zitten in het zout kussen (voorgesteld als een omgekeerde zwarte driehoek) gelegen in het V-kanaal. </p>

<ol>
	<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Cloning: A Laboratory Manual</em>. , (1989).</li></ol>

<p class="jove_content"> De duur van de termijn zal sterk afhangen van de grootte van de fragmenten, die normaal voor de fragmenten van maximaal 20 kb 50 minuten tot 1 uur is genoeg, terwijl voor kleine fragmenten UV-licht controle op elke 10 minuten is vereist om het fragment te voorkomen om door de zout kussen en bijgevolg de anodal buffer kamer afnemende herstel. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat wanneer u uw voeding op 100 volt, is er een stroom van ten minste 10 MAMP. De DNA-band kan worden gecontroleerd met behulp van een UV-lamp en de hand detecteren wanneer dit verlaat de gel slice. Het kussen zout kan ook gemaakt worden met 3 M Na-acetaat. </p><p class="jove_content"> Deze procedure laat de zuivering van DNA of RNA-fragmenten van verschillende afmetingen met een goede recovery (~ 80%), voor radioactief, verteerd door restrictie-enzymen, verwerkt door aanpassing van enzymen, etc. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NdeI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>R0111L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HindIII</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>R0104L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NH<sub>4</sub> acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>JTBaker</td>
<td>0596</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>6131 000 020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroeluter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>IBI</td>
<td>UEA CAT 46000</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

electroeluting dna fragments

<p class="jove_content"> Gezuiverde DNA-fragmenten worden gebruikt voor verschillende doeleinden in Moleculaire Biologie en ze kunnen worden bereid door verschillende procedures. De meesten van hen vereisen een eerdere elektroforese van de DNA-fragmenten, om de band van belang te scheiden. Dan is deze band weggesneden uit een agarose-of acrylamide gel en gezuiverd door middel van: binding en elutie van glazen of silica deeltjes, DEAE-cellulose membranen, &quot;crush en genieten methode&quot;, elektro of heel vaak dure commerciële zuivering kits. Zo zal het selecteren van een methode grotendeels afhankelijk zijn van wat er beschikbaar is in het laboratorium. De elektro-procedure maakt het mogelijk om te zuiveren zeer schoon DNA te worden gebruikt in een groot aantal toepassingen (sequencing, radiolabeling, enzymatische beperking, enzymatische modificatie, klonen etc). Deze procedure bestaat uit het plaatsen van DNA-band-bevattende agarose of acrylamide sneetjes in monster putjes van de electroeluter, dan is toepassing van de huidige zal het DNA-fragment op de agarose te verlaten en dus gevangen in een kussen zout zijn om later worden teruggevorderd door ethanolprecipitatie. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Electroeluting DNA Fragments at JoVE.com

Electroeluting DNA Fragments

<p class="jove_content">Deze procedure laat de zuivering van DNA-fragmenten met een hoog rendement.</p>

Electroeluting DNA-fragmenten

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methylated DNA Immunoprecipitation

Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA-Stabiele Isotopen sondering (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualisatie van DNA-replicatie in de gewervelde Model Systeem DT40 met behulp van de DNA-Fiber Techniek

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA fragmenten

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Bereiding van DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstratie van Proteolytische Activering van de epitheliale natrium kanaal (ENaC) door het combineren Huidige Metingen met de Opsporing van splitsingsfragmenten

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...