Name: electroeluting dna fragments
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroeluting DNA Fragments at JoVE.com

<p class="jove_content"> Çalışma Dr. Bermudez laboratuvar Conacyt (Hibe # 82.622) tarafından finanse edildi. Teşekkür Biz Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez ve Ximena Rodriguez-Torres electroleution prosedürü video kayıt için. </p>

<ol><li> Arındırılmalıdır ilgi DNA parçaları seçmek için, bu agaroz çözülebilir veya akrilamid jeller 1 saat için 120 volt 0.5x TBE tamponu (Tris borat, EDTA) kullanılarak elektroforez etidyum bromür ile boyanmış jel. Bunun için, plazmid pProEx-GdMre11S ~ 700 ng (6000 bp), daha önce NdeI ve HindIII ile sindirilir 900 bp parçası (parçası plazmid ve 84 ng 560 ng) serbest bırakmak için kullanılır. </li><li> Electroeluter tankı (Şekil 1), orta plato üzerine onu dökmeyin özen orta platonun her iki tarafında eşit olarak dağıtılmış 0.5x TBE ile doldurulması gerekir. </li><li> Seçilen grubun (veya grup) jel kesip, numune odasında V kanal (her bir dilim) mümkün olduğunca yakın olarak yerleştirilir. Koşu tampon her iki mecliste de eklenmelidir; jel dilim karşılamak için yeterli. </li><li> Sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcığı ortadan kaldırmak için kullanılan her V kanalı Pasteur pipeti ile yıkanmalıdır. </li><li> Sonra 10 M NH <sub>4</sub> asetat (Bromophenol Mavi küçük bir miktar yeterli renk eklenir, görselleştirme kolaylaştırmak için) 100 ul V kanal içinde yavaşça eklenir. </li><li> Yüksek tuz yastık herhangi bir tabanda önlemek için kapağı hafifçe kapatılmış olmalıdır. </li><li> Electroelution 25 dakika için 100 volt başlandı. </li><li> Electrolution tamamlandığında, 400 ul V-kanal kaldırıldı ve 1 saat veya gece boyunca soğuk etanol ve glikojen (DNA kurtarma artırmak için önerilir) 2 cilt, 4 ° C ile çöktürülmüş mikrofuge&#39;de tüp yerleştirilir. </li><li> 20 dakika boyunca santrifüj, süpernatant kaldırmak ve% 70 etanol ile yıkayın. </li><li> Kuru tüp ve OD 260 nm DNA ölçmek. </li><li> Elde edilen geri kazanım oranı% 75 idi (84 ng V-kanal yerleştirildi 63 ng iyileşti). </li></ol><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="Şekil 1" /><br /> <strong>Şekil 1</strong> Electroeluter diyagramı. Anot, bir katot dilimlenmiş jel bulunan tank, DNA her tarafında gösterilir (siyah kare olarak gösterilen) negatif yük nedeniyle katot doğru göç edecek. Sonra V-kanal bulunan tuz minder ters bir siyah üçgen olarak temsil kalmış olacak. </p>

<ol>
	<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Cloning: A Laboratory Manual</em>. , (1989).</li></ol>

<p class="jove_content"> Çalıştırma süresi kadar parçaları için normalde parçalarının boyutu çok bağlı olacaktır küçük parçaları için her 10 dakikada bir izleme UV ışık geçmek parçası önlemek için gerekli iken 20 kb 1 saat 50 dakika yeterlidir tuz yastık ve dolayısıyla kurtarma azalan anodal tampon odasına. 100 volt güç kaynağı, bir akım en az 10 mAmp olduğunu emin olmak için çok önemlidir. DNA bant UV el lambası ile izlenmekte ve bu jel dilim ne zaman terk tespit edilebilir. Yastık tuz 3 M Na asetat ile de yapılabilir. </p><p class="jove_content"> Bu prosedür, modifiye enzimler, vb. Tarafından işlenen iyi kurtarma (~% 80) ile farklı boyutlarda DNA veya RNA parçaları arıtma kısıtlama enzimler tarafından sindirilemez, radyoaktif olması </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NdeI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>R0111L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HindIII</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>R0104L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NH<sub>4</sub> acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>JTBaker</td>
<td>0596</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>6131 000 020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroeluter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>IBI</td>
<td>UEA CAT 46000</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

electroeluting dna fragments

<p class="jove_content"> Saf DNA parçalarının Moleküler Biyoloji farklı amaçlar için kullanılır ve çok sayıda prosedür tarafından hazırlanmış olabilir. Çoğu ilgi grup ayırmak için, DNA parçalarının bir önceki elektroforez gerektirir. Sonra, bu grubun bir agaroz veya akrilamid jel eksize edilip kullanarak saflaştırılmış: cam veya silika partikülleri, DEAE-selüloz membranlar, bağlayıcı ve elüsyon &quot;yöntemi ezmek ve emmek&quot; electroelution ya da çok sık pahalı ticari arıtma kitleri. Böylece, bir yöntem seçerek çoğunlukla laboratuvar mevcuttur ne bağlı olacaktır. Electroelution prosedür uygulamaları çok sayıda (sıralama, Radyoaktif, enzimatik kısıtlama, enzimatik modifikasyonu, klonlama vb) kullanılmak üzere çok temiz DNA arındırmak için izin verir. Bu prosedür yerleştirerek oluşur DNA bant-sonra uygulayarak mevcut electroeluter örnek kuyu, içine agaroz veya akrilamid dilim içeren DNA parçalarının agaroz bırakmak yapacak ve böylece daha sonra etanol yağış ile kurtarılamaz bir yastık tuz hapsedilir. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Electroeluting DNA Fragments at JoVE.com

Electroeluting DNA Fragments

<p class="jove_content">Bu prosedür, yüksek verim DNA parçalarının arıtma sağlar.</p>

DNA Fragments Electroeluting

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methylated DNA Immunoprecipitation

Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA Kararlı-İzotop (DNA-SIP) Probing

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

DNA kırıntıları Ayrılma Agaroz Jel Elektroforezi

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

SeqA-DNA kompleksleri kristalleşmesi için DNA dupleksler optimizasyonu İteratif

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojellerinin hazırlanışı

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Bölünme Fragmentlerin Algılama ile Akım Ölçümleri birleştiren tarafından Epitel Sodyum Kanalı (ENaC) proteolitik Aktivasyonunun gösteri

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...