Name: rnai screening for host factors involved in vaccinia virus infection using drosophila cells
Uploaded: 2010-08-25T17:30:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells at JoVE.com

Bu çalışma NIAID (R01AI074951 U54AI057168) ve SC Penn Genom Frontiers Enstitüsü hibeleri ile desteklenen; NIH T32HG000046 TSM; NIH T32GM07229 ve T32AI007324 LRS.

Bölüm 1: 384 Şey Tabaklar RNAi <ol><li> Tarama için kullanılan reaktifler Standardizasyon esastır. Biz bireysel birçok Schneider medya, fetal sığır serumu, ve boyama reaktifleri test edin. Sonra biz, tüm ekranı için aynı çok kısım ve kullanın. </li><li> Herhangi bir tahlil için, salt biyolojik en müsait olduğunu belirlemek için birkaç farklı hücre hatları test etmek en iyisidir. Biz genellikle S2 DRSC hat kullanın. </li><li> 25 ° C tam Schneider medya Drosophila hücreleri büyütün. <ol class="lalpha"><li> Schneider medya </li><li> % 10 ısı inaktive FBS </li><li> 1X L-glutamin </li><li> 1X Kalem / strep antibiyotik </li></ol></li><li> Drosophila hücreleri yarı yapışık ve her dört günde bir, matara kapalı hücreleri pipetleme ve taze bir balona 01:10 hücreleri seyreltilmesi trypsinization olmadan geçişli. Hücreler deneyler için log fazı olmalıdır. </li><li> Plaka-plaka ve günden güne değişkenlik tüm sıvı eklemeleri için çok iyi plakaları otomatik sıvı taşıma kullanımı ile en aza indirilmiştir. Biz WellMate (Matrix) kullanın. </li><li> WellMate tüp hazırlayın. <ol class="lalpha"><li> Sprayhood ve% 70 etanol ile WellMate. </li><li> % 70 etanol ile ambalaj ve sprey tüp çıkarın. </li><li> WellMate pozisyon dağıtım boru kaset takın. </li><li> 25 ml% 70 etanol ile Başbakan boru. </li><li> 15 dakika, sonra başbakan başka bir 25 mL etanol etanol içinde tüp sterilize edin. </li><li> 50 ml steril PBS ile astarlanırsa boru durulayın. </li></ol></li><li> Şişeyi ve sayısı hücreleri yerinden oynatın. Pelet hücreleri (300xg, 5 dk)% 25 daha fazla olduğunu. Ortalama numaralı seribaşı hücrelerinin sayısı tahlil uzunluğuna göre optimize edilmesi gerekir. Otomatik görüntü analizi yaparken, hiçbir hücre topaklanma ile tek tek tabakalı bir görüntü segmentasyonu için idealdir. </li><li> 1.7x10 6 hücre / ml serum serbest Schneider medya pelet hücreleri tekrar </li><li> Biz 384 kuyucuğu 250ng/well bir konsantrasyonda dsRNA piyasada mevcut kütüphanesi ile önceden aliquoted ekran gerçekleştirmek. Her plaka birkaç kuyu elle eklenir, kontroller için boş bırakılır. Biz bir negatif kontrol olarak lusiferaz dsRNA kullanın. Biz güçlü bir RNAi kontrol olarak karşı dsRNA Konu (dIAP) kullanın. Dramatik hücre ölümü bu anti-apoptotik faktör sonuçlarının yıkmak ve aşağı knock kalitesini değerlendirmek için hızlı bir görsel yoludur. Son olarak, biz, bizim tahlil okuma kullanarak viral enfeksiyon inhibe doğrulamak için bir pozitif kontrol olarak, bu durumda beta-galacosidase viral muhabiri karşı dsRNA kullanabilirsiniz. Hücre tohumlama, kısım 1 ul dsRNA kolay görünüm için izin vermek için iyi köşeye zamanda plaka dsRNA lekelenme, daha sonra hücrelerin eklemeden önce kuyunun altındaki (300xg, 1 dak.) Üzerine çift iplikçikli santrifüj. </li><li> Her bir kuyu için yukarıda hazırlanan 10 mcL hücre eklemek için WellMate kullanın. </li><li> 300xg, 1 dakika santrifüj plakalar üzerine hücreleri Spin. </li><li> 45 dakika boyunca 25 ° C inkübatörde inkübe edin. </li><li> 20 mcL tam Schneider medya ekleyin ve 300xg, 1 dakika santrifüj. </li><li> Nemlendirilmiş Tupperware kapları koyun tabak, suda ıslatılmış kağıt havlu ile kaplı. 384 hacmi küçük, böylece, buharlaşma da kenarına kuyuların okumaları artefakt değişikliklere yol açabilir biyoloji, büyük etkileri olabilir. Bunu aşmak için, tabak, yüksek nem altında tutulmalıdır. </li><li> Sağlam demonte izin vermek için üç gün boyunca inkübe edin. Ortamı değiştirmek veya bu süre içinde nemlendirilmiş kapları açmak için gerek yoktur. </li></ol> Bölüm 2: Vaccinia Virüs ile Enfekte <ol><li> 15 dakika boyunca Quatricide sterilize edilen çok-kanallı aspiratör, daha sonra% 70 etanol içinde durulayın. </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi WellMate hazırlayın. </li><li> Serum serbest medya tam bir medya 01:05 seyreltilmesi ile enfeksiyon için 2% FBS ile Schneider medya hazırlayın. </li><li> 0,8 um şırınga aracılığıyla hücresel enkaz kaldırmak veya saflaştırılmış virüs kullanmak için filtre Filtre ham virüs stokunun. </li><li> 2 enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) elde etmek için% 2 serum Schneider medya vaccinia virüs sulandırınız. </li><li> WellMate boru PBS çıkarın ve tüp hava kabarcıkları serbest kadar seyreltilmiş virüs başbakan. </li><li> DsRNA ile tedavi edilen Drosophila hücreleri plakaları medya hafifçe kaldırmak için sterilize çok kanallı aspiratör ve vakum manifoldunun kullanın. </li><li> WellMate kullanarak plakaları üzerine de başına 30 mcL virüs koyun. </li><li> 300xg plakaları 1 dakika santrifüjleyin. </li><li> WellMate boru sterilize edin. 25 mL% 10 blea ile Başbakanch, 10 dakika bekleyin ve bir 25 ml% 10&#39;luk çamaşır suyu ile başbakan. </li><li> Başbakan tüp 50 ml su ile 50 ml% 70 etanol ile izledi. Ambalajın boru dönün. </li><li> Nemlendirilmiş Tupperware konteyner plakaları geri dön. 48 saat boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Bölüm 3: Boyama Tabaklar <ol><li> 10 dakika için 15 mcL% 4 formaldehit / PBS plakaları sabitleyin. Sıvı bir multi-kanal aspiratör ve vakum manifoldunun her adımı kullanarak kaldırılır. Plakalar, steril ekipman giderildi var ve reaktifler artık gerekli değildir. </li><li> Kaldır düzeltmek ve 30 mcL PBST (PBS +% 0,1 Triton-X) eklemek için kullanabilirsiniz WellMate. Ve tekrar 10 dakika inkübe edin. Tüp sterilize edilmelidir gerekmez hariç İşlet, yukarıda açıklandığı gibi WellMate. </li><li> Vaccinia enfeksiyonu saptamak için erken / geç vaccinia organizatörü tarafından yönlendirilen bir β-galaktosidaz muhabiri kullanın. </li><li> 10 dakika boyunca sıvı ve inkübe blok hücreleri (2% BSA ile PBST) çıkarın. </li><li> Blok primer antikor sulandırınız, sıvı kaldırmak ve her biri de çok kanallı kullanarak tekrar pipet (Matrix) 15 mcL antikor ekleyin. </li><li> Levhalar (300xg, 1 dak) Spin, net bir etiket ile kaplayın ve 4 ° C gecede inkübe. </li><li> Primer antikor çıkarın ve PBST 3 kez, her biri 10 dakika kuyuların yıkamak için WellMate kullanın. </li><li> Floresan ile işaretlenmiş sekonder antikor (FITC) ve blok içinde leke nükleer seyreltin ve multi-kanal tekrar pipet kullanarak kuyulara 15 mcL ekleyin. </li><li> Inkübe plakalar 1 saat oda sıcaklığında, ışıktan korunmalıdır. </li><li> Kuyu PBST 3 kez, WellMate kullanarak her biri 10 dakika yıkayın. </li><li> 4 net etiket, kapak ve mağaza ile plaka Seal ° C üç hafta kadar. </li></ol> Bölüm 4: Görüntüleme ve Görüntü Analiz <ol><li> 20X büyütmede otomatik bir mikroskop görüntü tabak kullanın. </li><li> Toplam çekirdekleri (DAPI) ve enfekte olmuş hücreleri (FITC) görüntüleri yakalayın. Dinamik aralık maksimize etmek için, her kanal için ayrı ayrı pozlama süresi optimize edin. </li><li> Beklenen odak düzlemi altındaki ve üstündeki uçakları yayılan görüntüleri, arayla 1um, Z yığını alarak otomatik odaklama fonksiyonu ince ayar yapın. Optimal odak düzlemli bulunmaktadır, buna göre otomatik odaklama ayarlarını. </li><li> Resim tüm plaka, Hoechst kanal (DAPI) ve virüs kanal (FITC) başına en az üç fotoğraf çekmek. Bir bütün olarak iyi temsil eden görüntüler yakalamak için iyi bir içinde birkaç farklı bölgelerden gelen siteleri seçin. </li><li> Segment resmi bir dergide yazmak ve her plaka için nükleer boyanma (toplam hücreleri) ve enfeksiyon (FITC) pozitif hücrelerin toplam sayısını hesaplamak için Kont Çekirdekler modülleri kullanmak için yazılım MetaXpress kullanın. </li><li> Yüzde enfeksiyon (100 * FITC pozitif / toplam hücre) hesaplayın ve dönüşümü giriş. </li><li> Adayları belirlemek için, her plaka medyan ve çeyrekler açıklığı dayalı sağlam bir Z skoru kullanın. Bu yöntem aykırı ve nonsymmetric veri duyarsız ve böylece, hatta zayıf veya orta derecede hit 10 tanımlanması daha fazla güç sağlar. Her plaka için, medyan log-dönüştürülmüş verileri çıkarılır. Daha sonra elde edilen değerler 0.74 kez çeyrekler açıklığı (75 persentil ve 25. yüzdelik değerleri arasındaki fark) tarafından ayrılır. 0,74 faktörü yaklaşık bir standart normal dağılım için kullanılır. </li><li> Sağlam Z skoru plaka medyan standart sapma mesafe bir ölçüsüdür. Örneğin, 2 sağlam bir Z-skoru iyi% enfeksiyonu plaka medyan veya p &lt;0.05 ~ 2 standart sapma gösterir. </li><li> Hücre sayısı, sitotoksik adayları belirlemek için analiz edin. Nükleer sayar sağlam Z skoru hesaplayın. Adaylar ile sağlam bir yinelenen ekranlarında Z &lt;-2 sitotoksik olarak kabul edilir. </li><li> Sitotoksisite olmadan&gt; yinelenen ekranlarında 2 veya &lt;-2 (p &lt;0.0025) yüzde enfeksiyon için sağlam bir Z skoru Wells birincil ekran potansiyel aday olarak kabul edilir. </li><li> Olumlu adayların bağımsız reaktifler kullanılarak doğrulanır. dsRNAs mRNA başka bir bölgeye ilgi genlerin karşı oluşturulan ve yukarıdaki gibi test edilmektedir. </li><li> Iki bağımsız dsRNAs aynı fenotipe sahip olduğunuz bu genlerin daha fazla çalışma için kabul edilebilir. </li></ol> Bölüm 5: Temsilci Görüntüler ve Enfeksiyon Oranları yorumlanması <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 bulaşmamış kuyu iyi bulaşmış bir temsilcisi immünofloresan mikroskobu ile ölçülen vaccinia ifade beta-galaktosidaz (βgal) protein, pozitif boyanma hücreleri içeren, vaccinia virüs proteinler için herhangi bir boyama görünmüyor.Virüs = yeşil, çekirdeklerin = mavi. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Otomatik görüntü analiz yazılımı, kullanıcı tarafından belirlenen parametreler kullanılarak her görüntü enfeksiyon rakamlarla . Bir temsili görüntü, hücre çekirdekleri ve viral antijen eksprese eden hücrelerin sayısı toplam sayısı, büyüklüğü ve yerel arka plan boyanma üzerinde boyanma yoğunluğu dayanan sayılır. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 iplik (dIAP) demonte hedef genlerin sağlam RNAi tükenmesi için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir. Bu anti-apoptotik faktör demonte dramatik hücre ölümüne yol açar. Çekirdekler = mavi. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 lusiferaz demonte enfeksiyon çift iplikli RNA tedavi etkisi için bir negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Lusiferaz tükenmesi, tedavi edilmezse hücrelere göre enfeksiyon üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Virüs = yeşil, çekirdeklerin = mavi. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 βgal protein demonte enfeksiyon okundu olarak tahlil βgal protein düzeyleri kullandığından beri, bir enfeksiyon azaltılması için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir. Enfekte hücrelerin yüzdesinde bir azalma βgal sonuçlar tükenmesi. Virüs = yeşil, çekirdeklerin = mavi. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6, enfekte hücrelerin yüzdesinde bir azalma hücresel faktör Rab5 sonuç demonte . Rab5 endositoz katılmak için bilindiğinden, bu faktör, büyük olasılıkla vaccinia virüs giriş katkıda bulunmaktadır. Bu ekran bir örnek uç temsil eder. Virüs = yeşil, çekirdeklerin = mavi.

<ol>
	<li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells.">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li><li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response.">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li><li>Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+in+Drosophila+melanogaster+cells:+regulation+of+viral+transcription+and+replication.">Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication.</a> J Virol. 62, 277-284 (1988).</li><li>Sessions, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+insect+and+human+dengue+virus+host+factors.">Discovery of insect and human dengue virus host factors.</a> Nature. 458, 1047-1050 (2009).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+RNAi+screening+in+Drosophila+S2+cells:+what+have+we+learned+about+host-pathogen+interactions?.">Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions?.</a> Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).</li><li>Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication.">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454, 890-893 (2008).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+activity+coupled+with+fatty+acid+biosynthesis+is+required+for+viral+replication.">COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication.</a> PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+specific+sensitivity+of+IRES-containing+RNA+viruses+to+host+translation+inhibition.">Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition.</a> Genes Dev. 19, 445-452 (2005).</li><li>Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Kinome+RNAi+Screen+Identified+AMPK+as+Promoting+Poxvirus+Entry+through+the+Control+of+Actin+Dynamics.">A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells:+a+user's+guide.">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li></ol>

Drosophila genom RNAi tarama viral enfeksiyon hücresel bileşeni incelenmesi için sağlam ve etkili bir yöntem sağlar. Ev sahibi içsel immün yanıt bileşenleri ve terapötik hedefleri temsil edebilir viral replikasyon için gerekli ana protein faktörleri tanımlamak için kullanılır. Drosophila hücreleri, bir çok memeli virüs bulaştırmak. Bir ekran, tahlil yapmadan önce dikkatli bir hücre tipi, hücre sayısı ve enfeksiyon seviyesi için optimize edilmiş olmalı ve 11 pozitif ve negatif viral ve hücresel hedefleri de dahil olmak üzere kontrol edilmelidir. Önce tarama testinin dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için pozitif ve negatif kontroller arasında yeterli ayırma sağlamak için önemlidir. Ekran yapıldıktan sonra, adaylar, ev sahibi mekanizmaları enfeksiyona katkıda bulunan belirlemek için işlevsel kategoriler halinde bölünmüş olabilir. Vaccinia gibi memeli virüsler için, RNAi memeli homologları katkısı ikincil analizi bir parçası olarak tespit edilmelidir. Birlikte ele alındığında, bu güçlü tarama yöntemlerinin bize virüsler, konak hücreleri ile etkileşimde bulunduğu karmaşık mekanizmaları anlamak için izin verir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>35050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin (pen/strep)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screening</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Genome-wide dsRNA library</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384 well plates, black with clear bottom</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3712</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum seals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>6569</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear seals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Denville</td>
<td>B1212-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Well Mate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matrix</td>
<td>201-10001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 pin manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>3-000-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B2261</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescently-labeled secondary antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageXpressMicro automated microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MetaXpress image analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rnai screening for host factors involved in vaccinia virus infection using drosophila cells

Yalnızca virüs, insan hastalığının doğal salgın hastalıkların neden olabilir, ancak biyoterörizm onların potansiyel kullanımı da bir endişe, viral patojenlerin önemli bir kamu sağlığı tehdidi temsil eder. Hücresel faktörlerin daha iyi anlaşılması, çok ihtiyaç duyulan terapötikler etkisi enfeksiyon gelişimini kolaylaştıracağını söyledi. Çeşitli organizmaların tam genomu sıralama ile birleştiğinde RNA enterferans (RNAi) teknolojisi son gelişmeler genom, hücre tabanlı kayıp fonksiyon-ekranlar optimizasyonu yol açmıştır. Drosophila hücreleri nedeniyle genom ölçekli ekranlar özellikle mükellef bu sistemi 1 RNAi kolaylığı ve verimliliği. Önemlisi, virüslerin Drosophila hücreleri, tıbbi ve tarımsal önemi 2,3,4 memeli virüslerin sayısı da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede bulaşabilir. Drosophila Önceki RNAi ekranları giriş, çeviri ve RNA çoğaltma 5 virüs enfeksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli adımlar için gerekli konakçı faktörleri tespit ettik. Ayrıca, Drosophila hücre kültürü viral replikasyon için gerekli olan hücresel faktörlerin birçoğu da bu virüsler 4,6,7,8, 9 ile enfekte insan hücrelerinde sınırlayıcı. Bu nedenle, viral enfeksiyon sırasında eş-tarafından tercih ana faktörlerin belirlenmesi, antiviral tedavi için yeni hedeflere sunar. Burada bir örnek olarak vaccinia virüs kullanarak, viral enfeksiyon yer hücresel faktörleri belirlemek için bir yüksek verim RNAi ekran için genelleştirilmiş bir protokol mevcut.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells at JoVE.com

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral enfeksiyon katılan Roman konakçı faktörleri fonksiyonu RNAi tarama hücre tabanlı genom zarara tespit edilebilir. A<em&gt; Drosophila</em&gt; Hücre kültürü modeli RNAi kolaylığı ve verimliliği nedeniyle bu yaklaşım, özellikle mükellef. İşte biz bu tekniği kullanarak göstermek<em&gt; Vaccinia</em&gt; Örnek olarak virüs.

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Genler belirlenmesi için VIGS-aracılığı ile İleri Genetik Tarama konakçı olmayan Direnç ilgilendim


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Viral enfeksiyon ve analiz Drosophila Melanogaster ana bilgisayar virüs etkileşimin kurulması

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...