Name: visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification
Uploaded: 2010-11-15T17:03:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים NS-38849 ו DK-076160, Juvenile Diabetes Research Foundation המרכז לחקר סיבוכים של סוכרת, את תוכנית לנוירולוגיה מחקר גילוי אלפרד טאובמן א מכון המחקר הרפואי בבית אוניברסיטת מישיגן. עבודה זו השתמשו מורפולוגיה וניתוח תמונה Core המרכז לחקר הסוכרת והכשרה מישיגן, שמומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט 5P60 DK-20572 מן המכון הלאומי של סוכרת עיכול מחלות כליה. המחברים מודים סקוט קלארק מ ט בדיקות מולקולריות / Invitrogen עצה יקר שלו על השונות לחץ Edu-IT תיוג ערכות התרומה הנדיבה של ריאגנטים כדי לתמוך בפיתוח הראשוני של הטכניקה הגברה edu.

<ol>
	<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+mammals.">Mitochondrial fusion and fission in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).</li><li>Dimmer, K. S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(De)constructing+mitochondria:+what+for.">(De)constructing mitochondria: what for.</a> Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).</li><li>Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li><li>Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+matters:+control+of+mammalian+mitochondrial+DNA+copy+number.">Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number.</a> J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+incorporation+is+an+alternative+non-radioactive+assay+to+[(3)H]thymidine+uptake+for+in+vitro+measurement+of+mice+T-cell+proliferations.">EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations.</a> J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).</li><li>Heusden, J. V. a. n., Jong, P. d. e., Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein-labeled+tyramide+strongly+enhances+the+detection+of+low+bromodeoxyuridine+incorporation+levels.">Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).</li><li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+based+on+click+chemistry,+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation,+allowing+multiplex+antibody+staining.">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73, 626-636 (2008).</li><li>Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Ethynyl-2'-deoxyuridine+labeling+detects+proliferating+cells+in+the+regenerating+avian+cochlea.">5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea.</a> Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In.</a> Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+fission+in+mouse+neurons.">Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons.</a> Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).</li><li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells.">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).</li><li>Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+mitochondrial+DNA+occurs+throughout+the+mitochondria+of+cultured+human+cells.">Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells.</a> Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).</li><li>Amiri, M., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+in+the+axons+of+vertebrate+peripheral+neurons.">Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons.</a> Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פיתחנו assay רגיש תווית mtDNA מסונתז החדש של תאים בודדים באמצעות הגברה של האות tyramide edu. אחת הבעיות הגדולות במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול זה היה תוצאות לא עקביות בין coverslips. שינויים נעשו הפרוטוקולים ערכת Invitrogen כדי למנוע ערבוב בנפחים קטנים על coverslips הפרט ולהפוך פתרונות הורים לשימוש coverslips כל. ΜL 75-80 בשימוש עבור כל 12 מ&quot;מ זכוכית עגול coverslip הוא נפח אידיאלי כדי לכסות לחלוטין את פני השטח, תוך מתן פתרון מספיק כדי לתת תוצאות עקביות בין דגימות. פעמים דגירה ריכוזי מגיב היו אופטימיזציה אבל השיפורים ניתן לראות עם התאמות להם. הפרוטוקול נועד לרוץ כל תהליך פעם. עם זאת, כמה צעדים כבר חזר עם פתרונות חדשים כדי להתאושש דגימות לאחר שנכשלו בניסיון הראשון. בפרט, תגובת לחץ צעדים EDU (3.4-3.6) כבר חזר ללא עלייה משמעותית הקרינה רקע. אנטי אורגון Green-HRP הדגירה נוגדן (4.1-4.3) לבין הגברה tyramide (4.4-4.5) יש גם צעדים חוזרים ונשנים, אך לעתים קרובות יותר תוצאות אות עני יחס רעש בגלל הקרינה רקע מוגבר. ריאגנטים הרגישים ביותר הם תוסף לחץ Edu-IT חוצץ (Component G) הארנב נגד אורגון Green-HRP נוגדן (Component I) מן ערכת לחץ זה Assay microplate edu. תוסף זה לחץ Edu הצפת הופך בהדרגה צהוב לאורך זמן כאשר מאוחסנים 4 ° C ו בין 6-12 חודשים מכהה במידה ניכרת. אחסון של תוסף לחץ Edu-IT הצפת ב -20 ° C יהיה להקל על בעיה זו. תיוג צעדים הגברה tyramide העבודה הטובה ביותר כאשר הארנב נגד אורגון Green-HRP הנוגדן משמש בתוך 4-6 חודשים של ומשחזר אותו MilliQ DH 2 O. תיוג קלה של Edu ב mtDNA מאפשר השוואה ישירה עם סמנים נוספים הסלולר 9-11 ומשפר את השירות של טכניקה זו על אנלוגים thymidine אחרים, כגון 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU), אשר דורש טיפול קשה להתאושש שלה epitope בתוך הדנ&quot;א. המעבדה שלנו 11-12 ועוד 13-15 השתמשו בהצלחה BrdU לתייג mtDNA. הטכניקה תיוג BrdU דומה לזו שבוצעה על Edu אבל יש כמה הבדלים חשובים (איור 5). לאחר השלב permeabilization המפורטים לעיל (3.1-3.2), epitope BrdU הוא התאושש בצעד denaturation (2 N HCl למשך 30 דקות ב 37 ° C ואחריו שלושה שוטף ב 1X PBS). BrdU מסומן ואז עם נוגדן ראשוני נגד BrdU (וקטור מעבדות מדוללת 1:50 בתמיסה של 1% חסימה של ערכת ה-TSA ו מודגרות לילה ב 4 ° C). צעד משני הנוגדנים יש צורך להגביר את האות BrdU (אנטי עכבר עז IgG מצומדות כדי HRP של ערכות ה-TSA # 2 ו - # 5, מדולל 1:100 בתמיסה של 1% חסימה מודגרות 45 דקות בטמפרטורת החדר) לפני TSA צעדים (4.3-4.5 לעיל). שיש שני אנלוגים thymidine, Edu ו BrdU, כדי mtDNA תווית יתרון לביצוע ניסויים תווית כפול שבו mtDNA יכול להיות מתויג ברצף ב הדופק תיוג פרדיגמות 11. המעבדה שלנו היא באמצעות Edu ו BrdU תיוג של mtDNA לבחון את ויסות biogenesis המיטוכונדריה בהקשר של נוירופתיה סוכרתית, סיבוך נפוץ של מחלת הסוכרת. השתמשנו בהצלחה הגברה אות כדי למדוד שינויים mtDNA biogenesis נוירונים בודדים ב 11-12. טכניקה זו יהיה שימושי בניסויים אחרים שנועדו לחקור את המנגנונים של שכפול mtDNA מחזור או לזיהוי תרופות המעכבות סינתזה mtDNA. בנוסף לכך, העקרונות הבסיסיים של הגברה אותות Edu ו BrdU ניתן להחיל מחקרים אחרים כי ה-DNA למדוד שכפול או לתקן.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>12 mm coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-82</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>245 mm x 245 mm BioAssay Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm M</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PM-996</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>paraformaldehye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T-8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline 10X solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer Pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-7M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrogen peroxide, 30% in water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP2633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C10214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #12, with HRP&#x2014;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #15, with HRP&#x2013;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P-36931</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyclonal rabbit Neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB1981</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-BrdU antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>VP-B209</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #2, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #5, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20915</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification

המיטוכונדריה הם הרגולטורים העיקריים של אנרגיה תאית biogenesis המיטוכונדריה היא מרכיב חיוני של ויסות מספר המיטוכונדריות בתאים בריאים 1-3. גישה אחת לניטור biogenesis המיטוכונדריה היא למדוד את שיעור ה-DNA המיטוכונדריאלי (mtDNA) שכפול 4. פיתחנו טכניקה רגישה תווית mtDNA מסונתז החדש של תאים בודדים כדי ללמוד biogenesis mtDNA. הטכניקה משלבת שילוב של 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EDU) 5-7 עם הגברה אות tyramide (TSA) 8 פרוטוקול לדמיין שכפול mtDNA בתוך תאים subcellular של נוירונים. Edu עדיפה אנלוגים thymidine אחרים, כגון 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU), כי התגובה הראשונית לחץ Edu התווית 5-7 אינו מחייב את הטיפולים הקשים חומצה או אנזים מעכל הנדרשים חשיפת epitope BrdU . תיוג מתונה יותר של EDU מאפשרת השוואה ישירה ההתאגדות שלה עם סמנים תאיים אחרים 90-10. היכולת לחזות ולכמת biogenesis mtDNA מספקת כלי הכרחי לחקירת המנגנונים המשמשים להסדיר biogenesis המיטוכונדריה וגם יספק תובנות בפתוגנזה הקשורות רעילות התרופה, הזדקנות, סרטן ומחלות ניווניות. הטכניקה שלנו הוא ישים עצב סנסורי כמו גם סוגי תאים אחרים. השימוש בטכניקה זו כדי למדוד biogenesis mtDNA יש השלכות משמעותיות לקדם את ההבנה של הפיזיולוגיה הן הסלולר הרגיל, כמו גם מדינות מחלה לקוי.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

פיתחנו טכניקה רגישה תווית הדנ&quot;א המיטוכונדרי מסונתז החדש (mtDNA) בתוך תאים בודדים כדי ללמוד biogenesis mtDNA. הטכניקה משלבת שילוב של Edu יחד עם פרוטוקול tyramide הגברה (TSA) אות לדמיין שכפול mtDNA בתוך תאים subcellular של נוירונים.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA מיטוכונדריאלי של תאים בודדים על ידי הגברה אות Edu

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

ניגון אוטומטי של וידאו אינטראקטיבי ללימודי תקשורת של בעלי חיים

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

תיוג ממוקד של תאי עצב בתחומים ספציפיים מייקר פונקציונליים של הניאוקורטקס ידי שילוב אותות פנימיים והדמית שני פוטונים

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

הערכה של תפקוד Bioenergetic בתאי האנדותל מוחות דם

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת Assay ו- Ca2 +-עוררה Assay נפיחות מיטוכונדריאלי

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

הדמיה מתקדמת דיפוזיה בהיפוקמפוס של חולדות עם פגיעה מוחית טראומטית מתון

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...