Name: visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification
Uploaded: 2010-11-15T17:03:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья Гранты NS-38849 и DK-076160, детского диабета исследовательский фонд Центра по изучению осложнений при сахарном диабете, программы по неврологии Исследования и Открытия и Альфред Таубман А. Институт медицинских исследований в Университет штата Мичиган. Эта работа использованы Морфология и анализ изображений Ядро Мичиган диабета Научно-учебный центр, который финансируется Национальным институтом здоровья Грант 5P60 DK-20572 от Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний. Авторы выражают благодарность Т. Скотт Кларк из молекулярных проб / Invitrogen за ценные советы по различным Нажмите EDU-IT маркировки наборы и щедрое пожертвование реагентов для поддержки первоначального развития техники усиления EDU.

<ol>
	<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+mammals.">Mitochondrial fusion and fission in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).</li><li>Dimmer, K. S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(De)constructing+mitochondria:+what+for.">(De)constructing mitochondria: what for.</a> Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).</li><li>Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li><li>Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+matters:+control+of+mammalian+mitochondrial+DNA+copy+number.">Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number.</a> J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+incorporation+is+an+alternative+non-radioactive+assay+to+[(3)H]thymidine+uptake+for+in+vitro+measurement+of+mice+T-cell+proliferations.">EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations.</a> J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).</li><li>Heusden, J. V. a. n., Jong, P. d. e., Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein-labeled+tyramide+strongly+enhances+the+detection+of+low+bromodeoxyuridine+incorporation+levels.">Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).</li><li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+based+on+click+chemistry,+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation,+allowing+multiplex+antibody+staining.">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73, 626-636 (2008).</li><li>Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Ethynyl-2'-deoxyuridine+labeling+detects+proliferating+cells+in+the+regenerating+avian+cochlea.">5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea.</a> Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In.</a> Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+fission+in+mouse+neurons.">Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons.</a> Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).</li><li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells.">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).</li><li>Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+mitochondrial+DNA+occurs+throughout+the+mitochondria+of+cultured+human+cells.">Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells.</a> Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).</li><li>Amiri, M., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+in+the+axons+of+vertebrate+peripheral+neurons.">Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons.</a> Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы разработали чувствительный анализ для обозначения вновь синтезированных мтДНК в отдельных клеток с использованием tyramide усиления сигнала EDU. Одна из самых больших проблем во время оптимизации этого протокола было противоречивым результатам между покровные. Изменения были внесены в Invitrogen комплект протоколов, чтобы избежать смешивания небольших объемов по отдельным покровные и принятия решений мастер, используемый для всех покровные. 75-80 мкл для каждого 12 мм круговую стекло покровное является идеальным объемом, чтобы полностью покрыть площадь поверхности, обеспечивая при этом достаточно решения дают согласующиеся результаты между образцами. Инкубационный раз и концентрации реагентов были оптимизированы, но улучшений можно рассматривать с поправкой на них. Протокол предназначен для работы каждого процесса один раз. Однако некоторые шаги были повторяется с новыми решениями для восстановления образцы, которые не после первой попытки. В частности, нажмите EDU реакции шагов (3,4-3,6) были повторены без значительного увеличения фоновой флуоресценции. Анти-Oregon Green-HRP антител инкубации (4.1-4.3) и tyramide усиления (4,4-4,5) шаги были также повторяется, но чаще приводит к плохой сигнал-шум из-за повышенного фона флуоресценции. Наиболее чувствительных реагентов Нажмите EDU-IT буфера Аддитивные (компонент G) и кроличьих анти-Орегон Green-HRP антител (компонент I) от Click-IT EDU комплект Пробирной микропланшетов. Кликните-IT EDU буфера Аддитивные постепенно желтеет со временем при хранении при 4 ° С, а также между 6-12 месяцев значительно темнеет. Хранение Click-IT EDU буфера Аддитивные при температуре -20 ° С, снимет эту проблему. Маркировки и tyramide шаги усиления работают лучше, когда кролик анти-Орегон Green-HRP антител используется в течение 4-6 месяцев воссоздания его в MilliQ дН 2 O. Мягкая маркировка EDU в мтДНК позволяет прямое сравнение с дополнительными сотовой маркеров 9-11 и повышает полезность этого метода по сравнению с другими аналогами тимидина, такие как 5-бром-2-дезоксиуридина (BrdU), которая требует жестокого обращения для восстановления его эпитопом в ДНК. Наша лаборатория 11-12 и 13-15 других успешно использовали BrdU маркировать мтДНК. Техника BrdU маркировки похож на той, которая используется для EDU, но есть некоторые важные различия (рис. 5). После пермеабилизации шаг, перечисленных выше (3.1-3.2), BrdU эпитопа восстанавливается с денатурации шаг (2 N HCl в течение 30 мин при 37 ° С за которым следуют три моет в 1X PBS). BrdU затем помечены первичными антителами против BrdU (Vector Laboratories разбавленным 1:50 в 1% блокирующий раствор из TSA комплект и инкубировали в течение ночи при температуре 4 ° С). Вторичные антитела шаг необходим для усиления сигнала BrdU (антимышиного IgG конъюгированных с HRP от TSA комплектов № 2 и № 5, разбавленного 1:100 в 1% блокирующий раствор и выдерживают в течение 45 мин при комнатной температуре) до TSA шагов (4,3-4,5 выше). Наличие двух тимидина аналогов, EDU и BrdU, чтобы маркировать мтДНК является выгодным для выполнения двойной экспериментов этикетку мтДНК можно последовательно помечены в импульсно-маркировки парадигмы 11. Наша лаборатория использует EDU и BrdU маркировки мтДНК для изучения регуляции митохондриального биогенеза в контексте диабетической невропатии, частым осложнением сахарного диабета. Мы успешно использовали усиления сигнала для измерения изменений в мтДНК биогенеза в отдельных нейронов 11-12. Эта техника будет полезна и в других экспериментах, направленных на изучение механизмов репликации мтДНК и оборота или для выявления препаратов, которые подавляют синтез мтДНК. Кроме того, основные принципы усиления сигналов EDU и BrdU могут быть применены в других исследованиях, которые измеряют репликации ДНК или ремонта.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>12 mm coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-82</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>245 mm x 245 mm BioAssay Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm M</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PM-996</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>paraformaldehye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T-8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline 10X solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer Pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-7M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrogen peroxide, 30% in water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP2633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C10214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #12, with HRP&#x2014;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #15, with HRP&#x2013;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P-36931</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyclonal rabbit Neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB1981</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-BrdU antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>VP-B209</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #2, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #5, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20915</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification

Митохондрии являются ключевыми регуляторами клеточной энергии и митохондриального биогенеза является важным компонентом регулирования митохондрий номера в здоровые клетки 1-3. Один из подходов к мониторингу митохондриального биогенеза заключается в измерении скорости митохондриальной ДНК (мтДНК) репликации 4. Мы разработали чувствительный метод для обозначения вновь синтезированных мтДНК в отдельных клетках для изучения мтДНК биогенеза. Техника объединяет включения 5-этинил-2&#39;-дезоксиуридина (EDU) 5-7 с tyramide усиления сигнала (TSA) 8 протокола для визуализации мтДНК репликации в субклеточных отсеков нейронов. EDU превосходит другие аналоги тимидина, такие как 5-бром-2-дезоксиуридина (BrdU), потому что первая реакция нажмите на этикетке EDU 5-7 не требует суровых лечения кислоты или фермента дайджестов, которые необходимы для раскрытия BrdU эпитопа . Мягкой маркировке Edu позволяет прямое сравнение его включения с других клеточных маркеров 9-10. Способность визуализировать и количественно мтДНК биогенеза обеспечивает необходимый инструмент для исследования механизмов, используемых для регулирования митохондриального биогенеза и даст представление о патогенезе связанных с наркотиками токсичности, старения, рака и нейродегенеративных заболеваний. Наш метод применим для сенсорных нейронов, а также другие типы клеток. Использование этой методики для измерения мтДНК биогенеза имеет большое значение в содействии пониманию как нормальных, так клеточной физиологии, а также негативно болезненных состояний.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Мы разработали чувствительный метод для обозначения вновь синтезированных митохондриальной ДНК (мтДНК) в отдельных клетках для изучения мтДНК биогенеза. Техника объединяет включение образовательных вместе с tyramide усиления сигнала (TSA) протокол для визуализации мтДНК репликации в субклеточных отсеков нейронов.

Визуализация Митохондриальная ДНК репликации в отдельных клетках путем усиления сигнала EDU

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Автоматизированная Интерактивная Воспроизведение видео по изучению коммуникации животных

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Визуализация проприорецепторов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки и куколки

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

Целевые маркировки нейронов в конкретных функциональных микро-области коры головного мозга путем объединения Внутренняя сигнала и Двухфотонные изображений

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Метод высокой верности Optogenetic управление отдельными пирамидальных нейронов<em&gt; В естественных условиях</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Оценка Биоэнергетической функции в церебральный эндотелиальных клеток сосудов

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Митохондриальной Ca2 + сохранение потенциала пробирного и Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек Assay

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric кальция изображений отдельных нейронов в себя Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Расширенный диффузии изображений в гиппокампе крыс с мягкой травматического повреждения головного мозга

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...