Name: visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification
Uploaded: 2010-11-15T17:03:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag NS-38.849 och DK-076.160, Juvenile Diabetes Research Foundation Centrum för studier av komplikationer vid diabetes, Programmet för neurologi forskning och upptäckter och The A. Alfred Taubman Medical Research Institute vid University of Michigan. Detta arbete använde Morfologi och bildanalys Kärnan i Michigan Diabetes Research and Training Center, som finansieras av National Institutes of Health Grant 5P60 DK-20.572 från National Institute of Diabetes and Digestive-och njursjukdomar. Författarna tackar Scott T. Clarke från molekylära sonder / Invitrogen för hans värdefulla råd om olika Click-iT EDU märkning kit och generös donation av reagenser för att stödja den inledande utvecklingen av Edu förstärkningsteknik.

1. Beredning av nervceller <ol><li> Dorsala ganglion (DRG) nervceller odlas på steril (autoklaveras) 12 täckglas mm glas i ett 24-bra kultur plattan. </li><li> 10 mm lager av EDU (i DMSO, Klicka-IT EDU mikroplattor Assay Kit) är typiskt diluted 1:100 i odlingsmedium för att göra en 10X EDU-lösning (100 M) och sedan spädas 1:10 in i den kultur brunnar (t.ex. 30 ìl av 10X EDU lösningen i sammanlagt 300 mikroliter odlingsmedium). DRG nervceller inkuberas med en slutlig koncentration av 10 mikroM EDU vid 37 ° C och 5% CO 2 mellan 2-24 timmar. Hur lång tid beror på hur behandlingar påverkar graden av mtDNA syntes. </li><li> I ett dragskåp är DRG nervceller som fastställs i 2% paraformaldehyd i 10-15 minuter i rumstemperatur, tvättade två gånger i 1X PBS 2-5 minuter varje tvätt och lagras i färskt 1X PBS för upp till 1 månad vid 4 ° C. </li><li> Täckglas överförs med spetsig pincett för ett förberett fuktkammare (Corning bioassay maträtt med svart tapetserad botten för kontrast, insvept i aluminiumfolie för att skydda ljuskänsliga komponenter och fuktas med vatten mättade Kimwipes) och placeras på ett ark med Parafilm M som ger en hydrofob yta att begränsa lösningar på täckglas. Protokollet nedan är avsedd för 28 täckglas och lösningar är förberedda för 32 täckglas (ca 14% extra volym). Lösningar med dyra eller begränsad komponenter är tillverkade så att 75-80 mikroliter används på varje täckglas. Annars är 200-300 mikroliter används för tvätt och blockera lösningar för att tvätta ur tidigare lösningar. </li><li> Ny ansökan 1X PBS för att täcka ytan på varje täckglas (200-300 mikroliter). Förbered Klicka på-det-analysen och tyramide signal kit förstärkning som beskrivs nedan och i tillverkarens instruktioner. </li></ol> Beredning av Klicka-IT EDU mikroplattor analys Kit De flesta komponenter från Klicka-IT EDU mikroplattor Assay Kit kommer färdiga och lagras vid 4 ° C [2x Klicka-IT Reaktion Buffer (10x Komponent E), CuSO4 (100 mm, Komponent F) Klicka-IT EDU fixativ ( Komponent D) och blockerande buffert (2x Component H)]. Klicka på-det EDU Buffer Tillsats (10x Component G) lagras vid -20 ° C för att förhindra den från att vrida gul-brun med tiden. Denna komponent tål upprepade frys-tö cykler. Oregon Grön 488 Natriumazid (Komponent B) bör delas in i små alikvoter (10-20 mikroliter) för att minimera frys-tö cykler och förvaras vid -20 ° C. För att bereda en stamlösning av anti-Oregon Grön HRP konjugat (del I), lägg till 75 mikroliter av Milli Q dH 2 O till flaskan. Blanda genom försiktig pipettering eller genom att vända för att undvika skumbildning och förvara vid 4 ° C. Inte virvel. Beredning av TSA Sats # 12, med HRP get anti-kanin IgG och Alexa Fluor 488 Tyramide Kit För att förbereda tyramide stamlösning, lös det fasta materialet (Alexa Fluor 488 tyramide, Komponent A) i 150 mikroliter av DMSO (Komponent B). Vänd flaskan flera gånger för att lösa upp tyramide beläggning sidorna av flaskan. Förvara stamlösning i små portioner (10-20 mikroliter) vid ≤ -20 ° C, uttorkade och skyddas från ljus. 2. Klicka på-det 5-ethynyl-2-deoxiuridin (EDU) märkning OBS: Alla lösningar är bort med en lampa överföringspipett med 200 mikroliter spets fäst på slutet för att försiktigt ta bort vätskor utan att förlora celler. Undvik att använda en dammsugare linje, som brukar ta bort lösningar alltför kraftigt. En glödlampa pipett används för att försiktigt översvämning täckglas med 200-300 mikroliter av tvätt lösningar för att tvätta ur den tidigare lösningen. <ol><li> Celler är permeabilized med 0,1% Triton-X-100 i 1X PBS-lösning i 10 minuter i rumstemperatur i en täckt fuktig kammare. Använd 1% Triton-X-100 stamlösningar. <ul><li> Gör 3000 mikroliter på 0,1% Triton-X-100 genom att tillsätta 300 mikroliter 1% Triton-X-100 lager till 2700μL 1X PBS. </li><li> Använd 75-80 mikroliter per täckglas. </li></ul></li><li> Ta bort Triton X-100 lösning och skölj två gånger med 1X PBS. </li><li> Endogen peroxidas aktivitet är släckt med en 1% H 2 O 2 i 1X PBS-lösning i 30 minuter i rumstemperatur. Späd 30% H 2 O 2-lösning med 1X PBS. Denna lösning bör göras färsk men kan göras under 10 minuter permeabilization steg ovan (steg 3,1). <ul><li> Gör 3000 mikroliter av en 1% H 2 O 2 genom att tillsätta 100 mikroliter 30% H 2 O 2 till 2900 mikroliter 1X PBS. </li><li> Använd 75-80 mikroliter per täckglas. </li><li> Ta bort peroxidas lösningen och skölj två gånger med 1X PBS. </li></ul></li><li> Klicka på-det EDU reaktion <ul><li> För 32 täckglas (32 × 80 mikroliter =2560 mikroliter) totalt 2560 mikroliter behövs. Den 2x reaktionen är tillverkad i 1280 mikroliter, vilket är hälften av den totala reaktionen. </li><li> Färskt förbereda Klicka-IT Reaktion Cocktail före start av 5 minuter efter fix (steg 3,5 nedan). </li><li> Blanda cocktail genom att pipettera upp och ned. Inte vortexblandare när du gör denna reaktion. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 x Reaktion Cocktail Komponenter är från Klicka-IT EDU mikroplattor analys Kit </td><td> Hälften Volym: 1280 mikroliter </td></tr><tr><td> Milli Q dH 2 O </td><td> 1132,8 mikroliter </td></tr><tr><td> 2x Klicka-IT Reaktion Buffer (10x Komponent E) </td><td> 100,3 mikroliter </td></tr><tr><td> Klicka på-det EDU Buffer Tillsats (10x Component G) </td><td> 25,6 mikroliter </td></tr><tr><td> CuSO 4 (100 mm, Komponent F) </td><td> 25,6 mikroliter </td></tr><tr><td> Oregon Grön Azid (Komponent A) </td><td> 6,4 mikroliter </td></tr><tr><td> Totalt </td><td> 1290,7 mikroliter </td></tr></tbody></table> OBS: De mängder som används ovan är proportionell till de volymer som anges i Klicka-IT EDU mikroplattor riktningar analys kit. Den slutliga volymen Reaktion Cocktail är något mer än 1280 mikroliter. </li><li> Den 2X Klicka på-det är reaktionen spädas med lika volym Klicka-IT EDU fixativ (Komponent D) till höger före användning. Blanda dessa tillsammans gör en enhetlig reaktion lösning för alla täckglas. </li><li> Lägg till 1290,7 mikroliter Klicka-IT EDU fixativ (Komponent D) till 1290,7 mikroliter reaktionen cocktail. Använd 75-80 mikroliter per täckglas. </li></ul></li><li> Post-fix nervceller med Click-IT EDU fixativ (Komponent D) i 5 minuter i rumstemperatur. </li><li> Ta bort fix och lägga reaktion cocktail från ovan (steg 3,4). Skydda från ljus och inkubera i 25 minuter vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort reaktionen Cocktail. Tvätta två gånger med utspädd 1X blockerande buffert (2X Component H). <ul><li> Gör 5200 mikroliter 1X blockerande buffert genom att späda 2600 mikroliter blockerande buffert (2x Komponent H) med en lika stor volym MilliQ d H 2 O (2600 l). Använd 75-80 mikroliter per täckglas. </li></ul></li><li> Enligt en epi-fluorescerande mikroskop, kontrollera om Oregon Grön färgning i kärnan av mitotically aktiv kontroll celler. </li></ol> 3. Tyramide signalförstärkning (TSA) i EDU Signal <ol><li> Tillsätt 1% TSA kvarter lösning till varje täckglas och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. <ul><li> Gör 6000 mikroliter av 1% TSA kvarter lösning som väger 0,06 g TSA Blocking Reagent (TSA kit # 12, Komponent D) och lägga till det i 6000 mikroliter 1X PBS. Vortex att blanda. Tillsats av 5% get serum i 1% TSA kvarter lösning kommer ofta att bidra till att minska icke-specifik bindning. </li></ul></li><li> Kortfattat snurra anti-Oregon Grön pepparrotsperoxidas antikropp lager (del I i Klicka-IT EDU mikroplattor Assay), beredd 2-24 timmar i förväg för TSA. Späd den primära antikroppen 1:300 i 1% TSA blockerande lösningen och invertera eller pipettera upp och ner försiktigt för att blanda. Inte vortexblandare att undvika störningar HRP-konjugerade antikroppar. Ta bort 1% TSA kvarter lösning tillsätts 75 mikroliter till varje täckglas och inkubera över natten vid 4 ° C. <ul><li> Antikroppen kan användas mer koncentrerad, såsom 1:150, men den levereras i begränsade mängder, så använd den sparsamt. Återigen kommer tillägg av 5% get serum i 1% TSA kvarter lösning hjälper ofta till att minska icke-specifik bindning av anti-Oregon Grön pepparrotsperoxidas konjugerad antikropp. </li><li> Gör 2560 mikroliter av en 1:300 antikropp lösning genom att tillsätta 8,53 mikroliter av beståndet kanin anti-Oregon Green-HRP (Klicka-IT Edu mikroplattor Assay) till 2560 mikroliter 1% TSA Blockering. Blanda genom försiktig pipettering eller inversion. </li></ul></li><li> Nästa dag, ta bort antikroppar lösningen och skölj tre gånger med 1X PBS. Inkubera täckglasen i den sista tvätten i ytterligare 30-60 minuter i rumstemperatur för att säkerställa att obundna primär antikropp tas bort. </li><li> Förbered Tyramide reaktion för 2560 mikroliter (32 täckglas x 80 mikroliter). <ul><li> Gör 400 mikroliter av en 0,15% H 2 O 2-lösning (100X) genom att tillsätta 2 ìl av 30% H 2 O 2 (TSA kit # 12, Komponent F) till 398 mikroliter Förstärkning Buffer (TSA kit # 12, Komponent E) . Detta bör göras precis innan det behövs. </li><li> För en slutlig volym på 2560 mikroliter kombinera: <ul><li> 25,6 mikroliter Tyramide-488 (TSA kit Komponent A) </li><li> 2508,8 mikroliter Förstärkning Buffer (TSA kit Komponent E) </li><li> 25,6 mikroliter 0,15% H 2 O 2 (från ovan för en slutlig 0,0015% H 2 O 2) </li><li> Ta bort 1X PBS och inkubera med Tyramide reaktionen i 15 minuter i rumstemperatur. </li></ul></li></ul></li><li> Ta bort Tyramide reaktion och skölj tre gånger med 1X PBS, inkubera i den sista tvätten i 30-60 minuter i rumstemperatur som tidigare. </li><li> Kontrollera om mtDNA märkning enligt ett epi-fluorescerande mikroskop. <ul><li> Mount täckglas på objektglas glas mikroskop med en antifade monteringsmedium, såsom Förläng Guld med DAPI. Alternativt kan Edu märkning och förstärkningen ska följas av vanliga lysrör immuncytokemi att märka andra cellulära markörer. </li></ul></li></ol> 4. Representativa resultat: Visualisering av mitokondrie-DNA replikering som markör för mitokondriernas biogenes Vi är intresserade av hur sensoriska neuron (figur 1) reglerar antalet mitokondrier. Detta protokoll kommer etiketten nyligen syntetiserade mtDNA med en fluorescerande markör som ett sätt att mäta nya mitokondrier. Införlivandet av syntetiska nukleotid Edu följt av klick kemi Oregon Green-azide och efterföljande förstärkning med Alexa-Fluor 488 tyramide resultat i märkningen av mtDNA med ett grönt fluorescerande signal (figur 2). Om gjort rätt, är den förstärkt grön signal tillräckligt högre än bakgrundsfluorescens (t.ex. cellulär autofluorescens eller en bieffekt av HRP-TSA reaktion). Denna teknik är utformad för att märka nya replikerade mtDNA för att visualisera och kvantifiera mtDNA biogenes inom subcellulära fack av nervceller (Figur 3). ENE märkning möjliggör efterföljande fluorescerande immuncytokemi att märka andra cellulära markörer som neurofilament (Figur 3D). TSA reaktionen kan också göras med andra fluorescerande Alexa Fluor tyramides som Alexa Fluor 594-tyramide. Detta resulterar i ett grönt fluorescerande kärnvapen signalen från Oregon Green-azide klicka reaktion i kärnan men ingen grön signal i mtDNA, som är omöjliga att upptäcka innan TSA. Den förstärkning med Alexa Fluor 594-tyramide intensifierar nukleära etiketten och avslöjar ingår EDU i mtDNA med röd fluorescerande signal (Figur 4). En liknande förstärkning förfarande används för att visualisera BrdU införlivande med nya syntetiska mtDNA (Figur 5), kräver dock denna metod ytterligare ett steg för att återvinna BrdU epitop av antingen en hård syra (HCl) eller enzym smälta, vilket inte är nödvändigt för Edu märkning. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Representant differential interferens kontrast (DIC) bilder av embryonala (vänster) och vuxna (till höger) dorsala ganglion (DRG) nervceller som vanligtvis används för analys. Bars = 10 mikrometer. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Schematiskt diagram som representerar förfarandet för märkning EDU i mtDNA med en grön fluorescerande signal. Schematiska representerar tre steg protokoll för märkning EDU i mtDNA med en grön fluorescerande signal. Mitotically aktiva F11 neuroblastom celler fungerar som en positiv kontroll och illustrera märkning mönster av Edu som ingår i kärn-och mitokondrie-DNA. Det första steget (P1) är att införa en tymidin analog till nyligen syntetiserade mtDNA genom att inkubera celler i närvaro av Edu. Det andra steget (P2) är baserad på klick kemi att märka införlivades EDU med en Oregon Green-azide. Grön signal syns i kärnan av celler som replikeras deras nukleärt DNA. Det sista steget (P3) är att förstärka Oregon Green-azide signal genom inkubering med HRP-konjugerade kanin antikropp mot Oregon Grön följt av inkubering med Alexa Fluor 488 märkta tyramide i närvaro av väteperoxid (H 2 O 2) för att visualisera grön signal i mtDNA. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Edu märkning av mtDNA i dorsala ganglion (DRG) nervceller. Nervceller inkuberas med Edu och signalen sedan förstärks för att avslöja mtDNA som ingår Edu. Representant fluorescens bilder överlagras på ljus visar grönt punktuell signaler förstärks EDU (EDU-OG-TSA, grön) införlivas nyligen syntetiserade mtDNA av både embryonala (A) och vuxna (BD) DRG nervceller. ENE märkning förfarandet kan för senare immunofluorescens färgning av neuronala markörer som neurofilament (D, αNF, i rött). Skala staplar = 10 mikrometer. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. Schematiskt diagram som representerar förfarandet för märkning EDU i mtDNA med en röd fluorescerande signal. Schematiska representerar tre steg protokoll för märkning EDU i mtDNA med en röd fluorescerande signal. Mitotically aktiva F11 neuroblastom celler fungerar som en positiv kontroll och illustrera märkning mönster av Edu som ingår i kärn-och mitokondrie-DNA. Det första steget (P1) är att införa en tymidin analog till nyligen syntetiserade mtDNA genom att inkubera celler i närvaro av Edu. Det andra steget (P2) är baserad på klick kemi att märka införlivades EDU med en Oregon Green-azide. Grön signal syns i kärnan av celler som replikeras deras nukleärt DNA. Det sista steget (P3) är att förstärka Oregon Green-azide signal genom inkubering med HRP-konjugerade kanin antikropp mot Oregon Grön följt av inkubering med Alexa Fluor 594 märkta tyramide i närvaro av väteperoxid (H 2 O 2) för att visualisera röd signal i mtDNA. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5. BrdU märkning och tyramide signalförstärkning med en grön eller röd fluorescerande signal i mtDNA. Schemat är förfarandet för märkning BrdU i nya syntetiseras mtDNA med antingen en grön eller röd fluorescerande signal. Ett första steg krävs att återvinna BrdU epitop antingen en syra (HCl) eller enzym smälta, vilket inte är nödvändigt för EDU märkning. Nästa steg är inkubering med en mus primärt anti-BrdU antikropp. Detta följs av inkubering med pepparrot (HRP)-konjugerade get-anti-mus antikropp. Slutligen är den signal som förstärks med en grön eller röd fluorescerande tyramide i närvaro av väteperoxid (H 2 O 2) för att visualisera signaler i mtDNA.

<ol>
	<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+mammals.">Mitochondrial fusion and fission in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).</li><li>Dimmer, K. S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(De)constructing+mitochondria:+what+for.">(De)constructing mitochondria: what for.</a> Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).</li><li>Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li><li>Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+matters:+control+of+mammalian+mitochondrial+DNA+copy+number.">Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number.</a> J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+incorporation+is+an+alternative+non-radioactive+assay+to+[(3)H]thymidine+uptake+for+in+vitro+measurement+of+mice+T-cell+proliferations.">EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations.</a> J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).</li><li>Heusden, J. V. a. n., Jong, P. d. e., Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein-labeled+tyramide+strongly+enhances+the+detection+of+low+bromodeoxyuridine+incorporation+levels.">Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).</li><li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+based+on+click+chemistry,+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation,+allowing+multiplex+antibody+staining.">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73, 626-636 (2008).</li><li>Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Ethynyl-2'-deoxyuridine+labeling+detects+proliferating+cells+in+the+regenerating+avian+cochlea.">5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea.</a> Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In.</a> Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+fission+in+mouse+neurons.">Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons.</a> Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).</li><li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells.">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).</li><li>Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+mitochondrial+DNA+occurs+throughout+the+mitochondria+of+cultured+human+cells.">Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells.</a> Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).</li><li>Amiri, M., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+in+the+axons+of+vertebrate+peripheral+neurons.">Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons.</a> Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).</li></ol>

Vi utvecklade ett känsligt test för att märka nyligen syntetiserade mtDNA i enskilda celler med hjälp av en tyramide signalförstärkning av EDU. En av de största frågorna under optimeringen av detta protokoll var motsägande resultat mellan täckglas. Ändringar gjordes till Invitrogen kit protokollen för att undvika blandning små volymer på enskilda täckglas och göra mästare lösningar att använda för alla täckglas. Den 75-80 mikroliter används för varje 12 mm runda glas täckglas är en idealisk volym för att helt täcka ytan samtidigt som tillräckligt lösning för att ge jämna resultat mellan proven. Inkubationstider och koncentrationer reagens har optimerats men förbättringar kan ses med anpassningar av dem. Protokollet är utformat för att köras varje process en gång. Men vissa av stegen upprepats med nya lösningar för att återhämta prover som misslyckades efter första försöket. I synnerhet har ENE klicka reaktionen steg (3,4-3,6) har upprepats, utan en betydande ökning av bakgrundsfluorescens. Den anti-Oregon Green-HRP antikropp inkubation (4,1-4,3) och tyramide förstärkning (4,4-4,5) steg har också upprepats, men oftare resulterar i en dålig signal brusförhållande på grund av den ökade bakgrundsfluorescens. De mest känsliga reagenser är Click-IT EDU Buffer Tillsats (Komponent G) och kanin anti-Oregon Green-HRP antikropp (del I) från Click-IT EDU mikroplattor analys kit. Click-IT EDU buffert Tillsats blir gradvis gult över tid när det förvaras vid 4 ° C och mellan 6-12 månader mörknar betydligt. Lagring av Click-IT EDU buffert Tillsats vid -20 ° C kommer att lindra detta problem. Märkningen och tyramide steg förstärkning fungerar bäst när kanin anti-Oregon Green-HRP antikropp används inom 4-6 månader med att återupprätta den i MilliQ dH 2 O. Den milda märkning av ENE i mtDNA möjliggör direkta jämförelser med extra cellulära markörer 9-11 och ökar nyttan av denna teknik jämfört med andra tymidinanaloger, såsom 5-bromo-2-deoxiuridin (BrdU), som kräver en hård behandling för att återhämta sig dess epitop inom DNA. Vårt laboratorium 11-12 och andra 13-15 har framgångsrikt använt BrdU att märka mtDNA. Den BrdU märkning Tekniken liknar den som används för Edu, men har några viktiga skillnader (Figur 5). Efter permeabilization steg som anges ovan (3,1-3,2) är BrdU epitop återhämtade sig med en denaturering steg (2 N HCl i 30 minuter vid 37 ° C följt av tre tvättar i 1X PBS). Den BrdU då är märkt med en primär antikropp mot BrdU (Vector Laboratories späds 1:50 i 1% blockerande lösningen från TSA satsen och inkuberas över natten vid 4 ° C). En sekundär antikropp steg behövs för att förstärka BrdU signal (get-anti-mus-IgG konjugerad till HRP från TSA kit # 2 och # 5, utspädd 1:100 i 1% blockerande lösningen och inkuberas i 45 minuter i rumstemperatur) före TSA steg (från 4,3 till 4,5 ovan). Att ha två tymidinanaloger, Edu och BrdU skall märka mtDNA är fördelaktigt för att utföra dubbla etiketter experiment där mtDNA kan sekventiellt märkas puls-märkning paradigm 11. Vårt laboratorium använder EDU och BrdU märkning av mtDNA att undersöka reglering av mitokondriell biogenes i samband med diabetisk neuropati, en vanlig komplikation vid diabetes. Vi har framgångsrikt använt signalförstärkning att mäta förändringar i mtDNA biogenes i enskilda nervceller 11-12. Denna teknik kommer att vara användbart i andra experiment för att utforska de mekanismer för mtDNA replikation och omsättning eller för att identifiera läkemedel som hämmar mtDNA syntes. Dessutom kan de grundläggande principerna för förstärkning EDU och BrdU signaler tillämpas på andra studier som mäter DNA-replikation eller reparation.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>12 mm coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-82</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>245 mm x 245 mm BioAssay Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm M</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PM-996</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>paraformaldehye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T-8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline 10X solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer Pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-7M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrogen peroxide, 30% in water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP2633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C10214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #12, with HRP&#x2014;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #15, with HRP&#x2013;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P-36931</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyclonal rabbit Neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB1981</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-BrdU antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>VP-B209</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #2, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #5, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20915</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification

Mitokondrierna är viktiga regulatorer av cellulära energi och mitokondriell biogenes är en viktig del av regleringen mitokondrier tal i friska celler 1-3. Ett tillvägagångssätt för övervakning mitokondriell biogenes är att mäta graden av mitokondrie-DNA (mtDNA) replikering 4. Vi utvecklade en känslig teknik för att märka nyligen syntetiserade mtDNA i enskilda celler för att studera mtDNA biogenes. Tekniken kombinerar Införlivandet av 5-ethynyl-2&#39;-deoxiuridin (EDU) 5-7 med en tyramide signalförstärkning (TSA) 8 protokoll för att visualisera mtDNA replikation inom subcellulära fack av nervceller. Edu är överlägsen andra tymidinanaloger, såsom 5-bromo-2-deoxiuridin (BrdU), eftersom den ursprungliga klicka reaktionen på etiketten ENE 5-7 inte kräver hårda syra behandlingar eller enzym smälter som krävs för att exponera BrdU epitop . Den mildare märkning av EDU möjliggör direkt jämförelse av dess införlivande med andra cellulära markörer 9-10. Förmågan att visualisera och kvantifiera mtDNA biogenes ger ett viktigt verktyg för att undersöka de mekanismer som används för att reglera mitokondriernas biogenes och skulle ge insikt i patogenesen i samband med narkotikamissbruk toxicitet, åldrande, cancer och neurodegenerativa sjukdomar. Vår teknik kan tillämpas på sensoriska nervceller och andra celltyper. Användningen av denna teknik för att mäta mtDNA biogenes har stor betydelse för att främja förståelsen av både normala cellulär fysiologi samt nedsatt stater sjukdom.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Vi utvecklade en känslig teknik för att märka nyligen syntetiserade mitokondrie-DNA (mtDNA) i enskilda celler för att studera mtDNA biogenes. Tekniken kombinerar införlivandet av EDU tillsammans med en tyramide signalförstärkning (TSA) protokoll för att visualisera mtDNA replikation inom subcellulära fack av nervceller.

Visualisering av mitokondrie-DNA replikering i enskilda celler med Edu signalförstärkning

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Automatisk Interaktiv Videouppspelning för studier av djurkommunikation

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver och puppor

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

Riktad Märkning av nervceller i specifika funktionella Micro-domän neocortex genom att kombinera Intrinsic Signal och två-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

En metod för High Fidelity Optogenetic kontroll av enskilda pyramidala nervceller<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Utvärdering av bioenergetisk Funktion i Cerebral vaskulära endotelceller

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitokondriell Ca2 + Retention kapacitet Assay och Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad Assay

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Proportionerlig kalcium avbildning av enskilda nervceller i beter sig Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Avancerad diffusions avbildning i hippocampus hos råttor med mild traumatisk hjärnskada

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...