Name: generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides at JoVE.com

وأيد هذا العمل من جانب التحالف لمكافحة السرطان جورجيا المنح R9028.

<ol>
	<li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+DNA+repair.">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li><li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast.">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li><li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair.">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li><li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+H:+the+enzymes+in+eukaryotes.">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li></ol>

وقد رعت إنتاج الفيديو لهذه المادة الحرارية فيشر العلمية ، التي تنتج الكواشف والأداة المستخدمة في هذا المنشور.

تم اكتشاف حقيقة أن الحمض النووي الريبي يمكن نقل المعلومات الوراثية DNA الجينومية مباشرة إلى الخلايا في الاستفادة من استخدام الحمض النووي الريبي oligos المحتوية الاصطناعية (oligos Dharmacon توليفها) 1. وكان هذا دليل على مبدأ أن الخلايا يمكن استخدامها التي تحتوي على جزيئات الحمض النووي الريبي أو تسلسل الحمض النووي الريبي فقط كقوالب لتخليق الحمض النووي. استخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على oligos لم يؤد فقط إلى المظاهرة التي يمكن نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي الريبي لمباشرة الحمض النووي الجيني دون الحاجة لعكس كتب الحمض النووي نسخة وسيطة ، ولكن أيضا لإثبات أنه يمكن استخدام RNA كقالب مثلي في إصلاح الحمض النووي من التلف من 1،3. يمكن جعل oligos من الحمض النووي الريبي فقط أو تحتوي على مجرد ريبونوكليوتيد احد مضمن في تسلسل الحمض النووي ، كما في المثال قدمنا ​​هنا. والمحتوية على الحمض النووي الريبي بنسبة ضئيلة واحد ريبونوكليوتيد جزءا لا يتجزأ من تصميم لتصحيح طفرة هراء في أليل trp5 معيبة الجيني. وكشفت عن نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي لريبونوكليوتيد الجينومية عن تغيير في النمط الظاهري (الخلية تنمو على المدى المتوسط ​​تفتقر التربتوفان) من الخلايا المستهدفة. ويقاس تردد تصحيح الجينات التي تم الحصول عليها مع جزئية تحتوي على الحمض النووي الريبي ، وذلك بالمقارنة مع من الحمض النووي فقط السيطرة بنسبة ضئيلة. قبل تنفيذ هذا الاختبار تصحيح الجينات في الخلية خلفيات مختلفة ، حيث أننا تحور جينات الخميرة مختلفة ، يمكننا الكشف عن أي عامل / ثانية تؤثر على وجه التحديد استهداف oligos المحتوية على الحمض النووي الريبي. وبالتالي ، لا يمكننا الكشف عن آليات كيفية خلايا تنظيم استقرار RNA / DNA الهجينة. ببساطة عن طريق تصميم أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي oligos المحتوية يمكننا تحديد احتمال لالمسالك RNA خاص ليكون بمثابة القالب في تعديل الحمض النووي ويمكننا تحديد تسلسل الحمض النووي الريبي استقرار محددة المضمنة في الحمض النووي. وعلاوة على ذلك ، يمكننا تحديد ما هي المفضلة في الجسم الحي لعوامل ركائز التفاعل مع الحمض النووي الريبي / الهجينة الحمض النووي. في حين أجريت دراسات عدة في المختبر ، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي أساسا قصيرة تحتوي على oligos ، لتوصيف وظيفة من العوامل التي يمكن التعرف على الحمض النووي الريبي في مختلطة مع الحمض النووي ، مثل الانزيمات H ريبونوكلياز 4 ، في وظائف الجسم الحي من H فضلا RNases كهوية من البروتينات الأخرى التي يمكن أن تؤثر على الحمض النووي الريبي / DNA الاستقرار الهجينة لا تزال مجهولة في معظمها. إمكانية الاستفادة من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على oligos بطول كبيرة (50 إلى 80 السائدة) وجودة أفضل (مثل الحمض النووي الريبي oligos المحتوية الحرارية العلمية Dharmacon) قد يفتح الطريق لدراسة طائفة واسعة من العمليات الجزيئية مباشرة في الجسم الحي في خلايا الفائدة. كما هو مبين في هذا التحول ، والفيديو باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على oligos يتطلب أساسا سوى بضع خطوات إضافية بالمقارنة مع التحول باستخدام جزيئات الحمض النووي ، لمنع تدهور بواسطة RNases. وبالتالي ، يمكن تطبيق التحويل باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على oligos لا يقتصر على نظام الخميرة ، ولكن إلى أي نوع من الخلايا أو الكائن الحي حيث تحول بواسطة الحمض النووي oligos متمكنا. في الختام ، واستهداف الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي الريبي oligos يتيح الفرصة لتوليد RNA / DNA الهجينة وribonucleotides المضمنة في الحمض النووي في الجسم الحي في الخلايا. الاستقرار والوظيفة وعواقب هذه في الجسم الحي ولدت رنا / يمكن تحليل الحمض النووي الهجينة ، وتميزت ، من المحتمل الكشف عن آليات غير معروف من إصلاح الحمض النووي والكشف عن استراتيجيات جديدة لاستهداف الجينات.

ألف الكواشف وتحويل وسائل الإعلام (وتعديلها من Storici ريسنيك ، 2006 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> YPD (الخميرة ببتون سكر العنب) : للحصول على 1 لتر ، و 10 خلاصة الخميرة ز ، 20 ز ببتون الصويا ، و 20 غرام سكر العنب. إضافة 15 آغار ز لجعل وسائل الاعلام الصلبة YPD. الأوتوكلاف قبل الاستخدام. تخزين في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل 1 : 0،1 M من خلات الليثيوم. إعداد مباشرة قبل التحول. 1 الحل هو حل العاملة ، وبالتالي انها مستعدة مباشرة من مسحوق. ليس هناك أي حل الأسهم. تبقي في درجة حرارة الغرفة. LiAc يزيد من نفاذية جدار الخلية الخميرة إلى الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل 2 : 0.1 م من خلات ليثيوم ، و 50 ٪ من البولي ايثيلين جلايكول 4000. كما حل 2 هو الحل العمل ويتم ذلك مباشرة من مسحوق. لا يوجد حل مستعدة الأسهم. تبقي في درجة حرارة الغرفة. الودائع PEG oligos على خلايا الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحتوية على الحمض النووي الريبي oligos (الحرارية العلمية Dharmacon) ، 50 - 80 - السائدة ، المحلاة ، وعدم تنقية deprotected. Resuspend إلى 250 pmoles / ميكرولتر. المحل في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمض النووي فقط oligos ، 50 - 80 - السائدة ، وغير المحلاة النقية. Resuspend إلى 50 pmoles / ميكرولتر. المحل في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SC - التربتوفان (وسائل الإعلام كاملة الاصطناعية تفتقر تريبتوفان) وسائل الاعلام الصلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخرز الزجاجي 0،5 سم القطر ، وتعقيمها قبل التعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريبونوكلياز حالا : ريبونوكلياز حل التطهير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدناز / ريبونوكلياز خالية ، وأنابيب الطرد المركزي العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدناز / ريبونوكلياز خالية ، وأنابيب مخروطية العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدناز / ريبونوكلياز خالية من الهباء ماصة معقمة مع نصائح ZAP : 100-200 لتر ، 100-1000 مل. </li></ol> باء مستعمرة مواد PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاشعال الحمض النووي ، وغير المحلاة النقية. تذوب في الماء المعقم إلى 50 pmoles / ميكرولتر. المحل في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طق بوليميريز الحمض النووي ، والعازلة ، dNTPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب PCR. </li></ol> جيم تنقية PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR تنقية عدة. </li></ol> دال جل الكهربائي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 العازلة TBE خ تشغيل (45 ملي ملي الإيثيلنديامين تريس بورات ، وtetraacetate 1) مخففة من TBE 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prestained علامة الوزن الجزيئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمض النووي تحميل صباغة. </li></ol> هاء تقييد عملية الهضم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنزيمات التقييد ، مخازن 10X ، BSA. </li></ol> F. معالجة جزئية للقلوي المحتوية على الحمض النووي الريبي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 M من محلول هيدروكسيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.2 متر من حل حمض الهيدروكلوريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 M - تريس من حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 الحل. </li></ol>

generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides

البوليمرات الاصطناعية قصيرة الحمض النووي ، [أليغنوكليوتيد] (oligos) ، هي أكثر الأدوات الفنية وعلى نطاق واسع في علم الأحياء الجزيئية. يمكن أن تنتج Oligos لاحتواء أي الحمض النووي الريبي أو التسلسل المطلوب ، ويمكن أن تكون على استعداد لتشمل طائفة واسعة من التعديلات الأساسية والسكر. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن تكون مصممة لتقليد oligos محددة التعديلات الحمض النووي ، وبالتالي ، يمكن أن تكون بمثابة أدوات مهمة للتحقيق في آثار الحمض النووي من التلف وآليات الإصلاح. وجدنا أن الحرارية العلمية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي Dharmacon oligos بطول يتراوح بين 50 و 80 النيوكليوتيدات يمكن مناسبة بشكل خاص للدراسة ، في الوظائف ، والمجراة ونتائج الحمض النووي الريبي الكروموسومات / الهجينة من الحمض النووي وribonucleotides المضمنة في الحمض النووي. يمكن RNA / DNA الهجينة شكل بسهولة خلال إصلاح الحمض النووي ، والنسخ والنسخ ، ومع ذلك ، فإن القليل جدا هو المعروف عن الاستقرار من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي في الخلايا الهجينة وإلى أي مدى يمكن أن تؤثر هذه الهجينة سلامة الوراثية للخلايا. المحتوية على الحمض النووي الريبي oligos ، وبالتالي ، تمثل ناقلات مثالية لإدخال الحمض النووي في الكروموزومات ribonucleotides وتوليد RNA / DNA الهجينة طول اختيار وتكوين قاعدة. هنا نقدم بروتوكول لدمج ribonucleotides في جينوم الخميرة نموذج النظام حقيقية النواة / السكيراء الجعوية /. حتى الآن ، استخدمت مختبرنا الحرارية العلمية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي Dharmacon oligos لتوليد RNA / DNA الهجينة على مستوى الكروموسومات في الخلية أنظمة مختلفة ، من البكتيريا إلى الخلايا البشرية.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides at JoVE.com

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

هذا العمل يوضح كيفية تكوين الحمض النووي الريبي الهجين / الحمض النووي على مستوى الكروموسومات وتكشف عن نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي الريبي لالجيني في خلايا الخميرة.

جيل من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي DNA في الجينوم الهجائن التي تحول باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على [أليغنوكليوتيد]

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

التحول من الحمض النووي البلازميد في كولاي استخدام أسلوب الصدمة الحرارية

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

استخراج عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من التربة والرواسب

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

الجينومية MRI -- وهو من الموارد العامة للدراسة أنماط تسلسل الحمض النووي داخل الجينوم

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

عزل وتوصيف المحتوية على الحمض النووي الريبي Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

الجينومية التحول من Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

جيل من الجينوم الحذف في خطوط خلايا الثدييات عبر كريسبر / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...