Name: generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקואליציה סרטן גאורגיה מענק-R9028.

<ol>
	<li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+DNA+repair.">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li><li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast.">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li><li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair.">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li><li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+H:+the+enzymes+in+eukaryotes.">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li></ol>

הייצור וידאו עבור מאמר זה נערך בחסות תרמו פישר סיינטיפיק, אשר מייצרת ריאגנטים מכשיר בשימוש בפרסום זה.

העובדה RNA יכולים להעביר מידע גנטי ישירות הדנ&quot;א הגנומי בתאים התגלה ניצול השימוש RNA המכיל oligos סינתטי (oligos Dharmacon מסונתז) 1. זה היה הוכחה של העיקרון כי ניתן להשתמש בתאים המכילים מולקולות RNA או RNA בלבד רצפים כתבניות עבור סינתזה של DNA. השימוש RNA המכיל oligos לא רק הוביל להפגנה כי המידע הגנטי ניתן להעביר ישירות מ-RNA ל-DNA הגנומי ללא צורך הפוכה עיבד DNA להעתיק ביניים, אלא גם הוכחה כי RNA יכול לשמש כתבנית הומולוגיים ב את התיקון של נזק לדנ&quot;א 1,3. Oligos יכול להתבצע של RNA בלבד או להכיל רק ribonucleotide בודד מוטבע ברצף ה-DNA, כמו בדוגמה שהצגנו כאן. RNA המכיל אוליגו יש אחד ribonucleotide מוטבע שנועדה לתקן את המוטציה שטויות את האלל גנומית trp5 פגום. העברת מידע גנטי ribonucleotide ל-DNA הגנומי מתגלה על ידי שינוי פנוטיפ (תא גדל על המדיום חסר טריפטופן) של התאים הממוקדים. התדירות של תיקון הגן שהושגו עם אוליגו RNA המכיל נמדד בהשוואה לזה של ה-DNA רק לשלוט אוליגו. על ידי ביצוע תיקון זה גן assay ברקע תאים שונים, כאשר אנו עוברים מוטציה גנים שמרים שונים, אנו יכולים לזהות מה גורם / ים משפיעים במיוחד על מיקוד על ידי RNA המכיל oligos. לפיכך, אנו יכולים לחשוף מנגנונים כיצד תאים מווסתים את היציבות של RNA / DNA כלאיים. פשוט על ידי תכנון גרסאות שונות של RNA המכיל oligos אנו יכולים לקבוע את הסבירות עבור מערכת RNA מסוים לשמש תבנית שינוי ה-DNA, ואנחנו יכולים לקבוע את יציבות מסוימת רצפי הרנ&quot;א מוטבע לתוך ה-DNA. יתר על כן, אנו יכולים לזהות מה הם העדיפו בשנת מצעים vivo גורמים אינטראקציה עם RNA / DNA כלאיים. בעוד מספר מחקרים במבחנה, בעיקר ניצול קצר RNA המכיל oligos, נערכו כדי לאפיין את הפונקציה של גורמים שיכולים לזהות רנ&quot;א היברידית עם ה-DNA, כגון אנזימים RNase H 4, בפונקציות vivo של RNases H כמו גם כזהות של חלבונים אחרים שיכולים להשפיע על RNA / DNA יציבות היברידית אינם ידועים ברובם. האפשרות לנצל RNA המכיל oligos באורך משמעותי (50-80, מרס) ובאיכות אופטימלית (כגון Thermo Scientific Dharmacon RNA המכיל oligos) יש לפתוח את הדרך בחינת מגוון רחב של תהליכים מולקולריים ישירות in vivo ב תאים של עניין. כפי שניתן לראות השינוי הזה וידאו, באמצעות RNA המכיל oligos דורש בעצם רק כמה צעדים נוספים לעומת השינוי באמצעות מולקולות ה-DNA, כדי למנוע השפלה ידי RNases. לכן, השינוי באמצעות RNA המכיל oligos אינו מוגבל למערכת שמרים, אבל יכול להיות מיושם על כל אורגניזם או סוג התא שבו שינוי ה-DNA על ידי oligos הוא מיומן. לסיכום, על ידי מיקוד תאים המכילים RNA oligos מספקת את ההזדמנות כדי לייצר RNA / DNA היברידיים ribonucleotides מוטבע ב DNA בתאי in vivo. היציבות, פונקצית וההשלכות של אלה in vivo שנוצר RNA / DNA כלאיים ניתן לנתח ומאופיינת, פוטנציאל חשיפת מנגנוני ידוע של תיקון DNA וגילוי אסטרטגיות חדשניות גן מיקוד.

א טרנספורמציה ריאגנטים המדיה (שונה מן Storici ו רזניק, 2006 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> YPD (שמרים Peptone דקסטרוז): עבור L 1, 10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם סויה peptone, 20 גרם דקסטרוז. הוסף 15 גר &#39;אגר לעשות התקשורת מוצק YPD. החיטוי לפני השימוש. אחסן בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 1: 0.1 M של ליתיום אצטט. הכן מיד לפני השינוי. פתרון 1 הוא פתרון של העבודה, ולכן הוא מוכן ישירות האבקה. פתרון ללא מניות הוא עשה. לשמור בטמפרטורת החדר. LiAc מגדיל את חדירות התא שמרים קיר ל-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2: 0.1 M של ליתיום אצטט ו -50% פוליאתילן גליקול 4000. כמו כן פתרון 2 הוא פתרון עבודה הוא עשה ישירות האבקה. פתרון ללא מניות מוכנה. לשמור בטמפרטורת החדר. פיקדונות PEG oligos על תאים ושמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA המכיל oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80, מרס, desalted, deprotected שאינם מטוהרים. Resuspend עד 250 pmoles / μl. חנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA רק oligos, 50-80, מרס, desalted שאינם מטוהרים. Resuspend עד 50 pmoles / μl. חנות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SC-TRP (התקשורת להשלים סינתטי חסר טריפטופן) מדיה מוצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקוטר 0.5 ס&quot;מ חרוזי זכוכית, מעוקרים ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNase-off: פתרון RNase טיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNase / RNase חופשי, מבחנות צנטריפוגה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNase / RNase חינם, צינורות חרוטי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNase / RNase חינם, פיפטה סטרילית אירוסול טיפים עם ZAP: 100-200 מ&quot;ל, 100-1000 מ&quot;ל. </li></ol> ב המושבה PCR חומרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA primers, desalted ולא מטוהרים. מתמוססים במים סטריליים עד 50 pmoles / μl. חנות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקי פולימראז ה-DNA, מאגר, dNTPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR צינורות. </li></ol> ג טיהור PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR ערכת טיהור. </li></ol> ד ג&#39;ל אלקטרופורזה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 x חיץ TBE ריצה (45 mM טריס-borate ו 1 ethylenediamine tetraacetate mM) מדוללת מ TBE 10x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prestained משקל מולקולרי הסמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA לצבוע הטעינה. </li></ol> E. העיכול סייג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלת אנזימים, מאגרים 10x, BSA. </li></ol> פ טיפול אלקליות עבור RNA המכיל אוליגו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 M NaOH של פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.2 מ &#39;של פתרון HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 M של טריס-HCl, pH 7.4 פתרון. </li></ol>

generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides

פולימרים סינתטיים קצר חומצות גרעין, oligonucleotides (oligos), הם כלי פונקציונלי ביותר נרחבת של הביולוגיה המולקולרית. Oligos יכול להיות מיוצר להכיל את כל ה-DNA הרצוי או רצף הרנ&quot;א יכול להיות מוכן לכלול מגוון רחב של הבסיס שינויים סוכר. יתר על כן, oligos ניתן שנועד לחקות שינויים ספציפיים חומצות גרעין, ולכן, יכול לשמש כלי חשוב לחקור את ההשפעות של נזק לדנ&quot;א מנגנוני התיקון. מצאנו כי Thermo Scientific Dharmacon RNA המכיל oligos עם אורך בין 50 ל 80 נוקלאוטידים יכול להיות מתאים במיוחד ללמוד, ב, פונקציות vivo וההשלכות של RNA כרומוזומליות / כלאיים דנ&quot;א של ribonucleotides מוטבע לתוך ה-DNA. RNA / DNA כלאיים יכול בקלות ליצור במהלך התיקון שכפול, שעתוק דנ&quot;א, לעומת זאת, מעט מאוד ידוע על היציבות של RNA / DNA כלאיים בתאים אשר במידה כלאיים אלה יכולים להשפיע על שלמות הגנטי של התאים. RNA המכיל oligos, אם כן, מייצגים וקטור המושלם להציג ribonucleotides לתוך הדנ&quot;א בכרומוזומים וליצור RNA / DNA כלאיים של אורך נבחר הרכב הבסיס. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור שילוב של ribonucleotides לתוך הגנום של שמרים מערכת אוקריוטים מודל / cerevisiae Saccharomyces /. עם זאת, במעבדה שלנו ניצלה Thermo Scientific Dharmacon RNA המכיל oligos לייצר RNA / DNA כלאיים ברמת כרומוזומליות במערכות תאים שונים, בין חיידקים לתאי האדם.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides at JoVE.com

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

עבודה זו מראה כיצד ליצור כלאיים RNA / DNA ברמה כרומוזומליות ולחשוף העברת מידע גנטי מ-RNA ל-DNA הגנומי בתאי שמרים.

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

הגנום MRI - משאב ציבורי עבור לימוד דפוסי בתוך רצף הדנ&quot;א הגנומי

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

שינוי גנטי של Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...