Name: generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00
Duration: 16 min 42 s
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यह काम जॉर्जिया कैंसर गठबंधन अनुदान R9028 द्वारा समर्थित किया गया था.

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	<li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+DNA+repair.">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li><li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast.">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li><li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair.">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li><li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+H:+the+enzymes+in+eukaryotes.">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li></ol>

इस अनुच्छेद के लिए वीडियो उत्पादन थर्मो फिशर साइंटिफिक, जो अभिकर्मकों और इस प्रकाशन में उपयोग किए गए साधन पैदा द्वारा प्रायोजित किया गया था.

तथ्य यह है कि शाही सेना आनुवंशिक जानकारी सीधे कक्षों में कर सकते हैं हस्तांतरण जीनोमिक डीएनए सिंथेटिक शाही सेना युक्त oligos का उपयोग (Dharmacon संश्लेषित oligos) 1 शोषण की खोज की थी. यह सिद्धांत का सबूत है कि कोशिकाओं के डीएनए संश्लेषण के लिए टेम्पलेट के रूप में शाही सेना अणु युक्त या शाही सेना केवल दृश्यों का उपयोग कर सकते हैं था. उपयोग शाही सेना युक्त प्रदर्शन करने के लिए न केवल नेतृत्व oligos कि शाही सेना से आनुवांशिक जानकारी सीधे स्थानांतरित कर सकते जीनोमिक डीएनए के लिए एक रिवर्स लिखित डीएनए प्रतिलिपि मध्यवर्ती की जरूरत के बिना, लेकिन यह भी सबूत है कि शाही सेना में मुताबिक़ टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एक 1,3 डीएनए क्षति की मरम्मत. oligos आरएनए ही बनाया जा सकता है या सिर्फ एक ही एक डीएनए अनुक्रम में एम्बेडेड ribonucleotide होते, उदाहरण के रूप में हम यहाँ प्रस्तुत है. आरएनए युक्त oligo एक एम्बेडेड जीनोमिक दोषपूर्ण एलील trp5 में बकवास उत्परिवर्तन सही डिजाइन ribonucleotide है. ribonucleotide से जीनोमिक डीएनए आनुवंशिक जानकारी के हस्तांतरण phenotype लक्षित कोशिकाओं (सेल tryptophan की कमी मध्यम पर बढ़ती) में एक बदलाव से पता चला है. जीन oligo शाही सेना युक्त के साथ प्राप्त सुधार की आवृत्ति मापा और यह है कि एक नियंत्रण डीएनए केवल oligo के साथ तुलना. अलग सेल पृष्ठभूमि, जहां हम विभिन्न खमीर जीन रूप बदलना में इस जीन सुधार परख प्रदर्शन करके, हम पता लगा सकते हैं जो कारक / एस विशेष रूप से शाही सेना युक्त oligos द्वारा लक्ष्यीकरण प्रभावित. इस प्रकार, हम कैसे कोशिकाओं / शाही सेना डीएनए संकर की स्थिरता को विनियमित तंत्र प्रकट कर सकते हैं. बस आरएनए युक्त oligos के विभिन्न वेरिएंट डिजाइन करके हम एक विशेष शाही सेना डीएनए में संशोधन टेम्पलेट के रूप में सेवा पथ के लिए संभावना का निर्धारण और हम विशिष्ट शाही सेना डीएनए में एम्बेडेड अनुक्रम की स्थिरता को निर्धारित कर सकते हैं कर सकते हैं. इसके अलावा, हम की पहचान कर सकते हैं शाही सेना डीएनए / संकर के साथ बातचीत करने वाले कारकों के लिए vivo substrates में क्या पसंद कर रहे हैं. जबकि इन विट्रो अध्ययन में कई, मुख्य रूप से कम उपयोग शाही सेना युक्त oligos, कारकों है कि एक संकर में डीएनए के साथ शाही सेना को पहचान सकते हैं, जैसे RNase एच 4 एंजाइमों RNases एच के vivo कार्यों में के रूप में अच्छी तरह के समारोह विशेषताएँ आयोजित किया गया है अन्य प्रोटीन है कि प्रभावित हो सकता है / शाही सेना डीएनए संकर स्थिरता ज्यादातर अनजान रहते हैं की पहचान के रूप में. संभावना का उपयोग करने के आरएनए युक्त एक महत्वपूर्ण (50 से 80 mers) लंबाई और इष्टतम गुणवत्ता के oligos (जैसे थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon आरएनए युक्त oligos) में vivo में सीधे आणविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए रास्ता खुला है ब्याज की कोशिकाओं. जैसा कि इस वीडियो, परिवर्तन में दिखाया का उपयोग शाही सेना युक्त oligos अनिवार्य रूप से केवल डीएनए अणु का उपयोग RNases से गिरावट को रोकने के परिवर्तन की तुलना में कुछ अतिरिक्त कदम की आवश्यकता है. इस प्रकार, परिवर्तन आरएनए युक्त oligos खमीर प्रणाली के लिए सीमित नहीं है, लेकिन का उपयोग कर किसी भी जीव या कोशिका प्रकार है जहां डीएनए oligos द्वारा परिवर्तन कुशल है करने के लिए लागू किया जा सकता है. अंत में, द्वारा कोशिकाओं को लक्षित शाही सेना युक्त oligos आरएनए / डीएनए संकर और ribonucleotides कक्षों में vivo में डीएनए में एम्बेडेड उत्पन्न करने का अवसर प्रदान करता है. स्थिरता, समारोह और vivo में इन के परिणामों आरएनए उत्पन्न / डीएनए संकर और विश्लेषण किया जा सकता है विशेषता है, संभावित डीएनए की मरम्मत के अज्ञात तंत्र uncovering और लक्ष्यीकरण जीन के लिए उपन्यास रणनीतियों का खुलासा.

ए परिवर्तन अभिकर्मकों और मीडिया (Storici और Resnick से संशोधित, 2006 <ol><li> YPD (खमीर Peptone Dextrose): एल 1 के लिए, 10 छ खमीर निकालने, 20 ग्राम सोया peptone, 20 ग्राम dextrose. 15 ग्राम अगर जोड़ें YPD ठोस मीडिया बनाने के लिए. उपयोग से पहले आटोक्लेव. कमरे के तापमान पर स्टोर. </li><li> 1 समाधान: लिथियम एसीटेट के 0.1 एम. परिवर्तन से पहले तुरंत तैयार है. 1 समाधान एक काम समाधान है, इस प्रकार यह सीधे पाउडर से तैयार है. कोई शेयर समाधान किया जाता है. कमरे के तापमान पर रखें. LiAc डीएनए के लिए खमीर कोशिका दीवार पारगम्यता बढ़ जाती है. </li><li> 2 समाधान: लिथियम एसीटेट के 0.1 एम और polyethylene के glycol 4000 के 50%. इसके अलावा 2 समाधान एक काम समाधान है और यह सीधे पाउडर से बना है. कोई शेयर समाधान तैयार है. कमरे के तापमान पर रखें. खूंटी जमा खमीर कोशिकाओं पर oligos. </li><li> आरएनए युक्त oligos (थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon), 50-80-mers, desalted, deprotected और गैर शुद्ध. 250 pmoles / μl Resuspend. -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस </li><li> डीएनए केवल oligos, 50-80-mers, desalted और गैर शुद्ध. 50 pmoles / μl Resuspend. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर </li><li> अनुसूचित जाति - टीआरपी (सिंथेटिक पूरा मीडिया tryptophan की कमी) ठोस मीडिया. </li><li> 0.5 सेमी व्यास ग्लास मनकों, autoclaving द्वारा निष्फल. </li><li> RNase परिशोधन समाधान: RNase-बंद. </li><li> DNase / RNase - मुक्त, बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूबों. </li><li> DNase / RNase - मुक्त, बाँझ शंक्वाकार ट्यूबों. </li><li> DNase / RNase - मुक्त, जैप के साथ बाँझ एयरोसोल विंदुक युक्तियाँ: 100-200 मिलीलीटर, 100-1000 मिलीलीटर. </li></ol> बी कालोनी पीसीआर सामग्री. <ol><li> डीएनए प्राइमरों, desalted और गैर शुद्ध. बाँझ पानी में 50 pmoles / μl भंग. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर </li><li> Taq डीएनए पोलीमरेज़, बफर, dNTPs. </li><li> पीसीआर ट्यूबों. </li></ol> सी. पीसीआर शुद्धि. <ol><li> पीसीआर शुद्धि किट. </li></ol> डी. जेल वैद्युतकणसंचलन. <ol><li> Agarose. </li><li> 1 एक्स TBE चल बफर (45 Tris borate मिमी और 1 मिमी ethylenediamine tetraacetate) 10x TBE से पतला है. </li><li> Prestained आणविक भार मार्कर. </li><li> डीएनए लोड हो रहा है डाई. </li></ol> ई. प्रतिबंध पाचन. <ol><li> प्रतिबंध एंजाइमों, 10x बफ़र्स, BSA. </li></ol> एफ oligo शाही सेना युक्त के लिए क्षार उपचार. <ol><li> 1 NaOH समाधान के एम. </li><li> एचसीएल समाधान के 1.2 एम. </li><li> 1 Tris - एचसीएल के एम, पीएच 7.4 समाधान. </li></ol>

generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides

सिंथेटिक कम न्यूक्लिक एसिड पॉलिमर oligonucleotides (oligos), आण्विक जीव विज्ञान की सबसे कार्यात्मक और व्यापक उपकरण हैं. Oligos के लिए किसी भी वांछित डीएनए या शाही सेना अनुक्रम होते हैं उत्पादन किया जा सकता है और बेस और चीनी संशोधनों की एक विस्तृत विविधता शामिल करने के लिए तैयार किया जा सकता है. इसके अलावा, oligos विशिष्ट nucleic एसिड परिवर्तन की नकल और इस प्रकार, महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सेवा करने के लिए डीएनए नुकसान और मरम्मत के तंत्र के प्रभाव की जांच कर सकते हैं बनाया जा सकता है. हमने पाया है कि थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon आरएनए युक्त 50 और 80 nucleotides के बीच एक लंबाई के साथ oligos विशेष रूप से अध्ययन करने के लिए उपयुक्त vivo में काम करता है, और गुणसूत्र आरएनए / डीएनए संकर के परिणामों में और डीएनए में एम्बेडेड ribonucleotides किया जा सकता है. / शाही सेना डीएनए संकर आसानी से डीएनए प्रतिकृति की मरम्मत, और प्रतिलेखन के दौरान फार्म कर सकते हैं, तथापि, कोशिकाओं में और किस हद तक इन संकर कोशिकाओं के आनुवंशिक अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं / शाही सेना डीएनए संकर की स्थिरता के बारे में बहुत कम जाना जाता है. Oligos शाही सेना से युक्त, इसलिए, एक परिपूर्ण गुणसूत्र डीएनए में ribonucleotides परिचय और शाही सेना डीएनए / संकर चुना लंबाई और आधार संरचना के उत्पन्न सदिश का प्रतिनिधित्व करते हैं. यहाँ हम यूकेरियोटिक मॉडल प्रणाली खमीर / Saccharomyces cerevisiae / के जीनोम में ribonucleotides के समावेश के लिए प्रोटोकॉल उपस्थित थे . फिर भी, हमारी प्रयोगशाला का उपयोग किया गया है थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon आरएनए युक्त oligos अलग सेल प्रणाली में गुणसूत्र के स्तर पर / शाही सेना डीएनए संकर उत्पन्न बैक्टीरिया से मानव कोशिकाओं के लिए.

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Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

इस काम से पता चलता है कैसे गुणसूत्र के स्तर पर / शाही सेना डीएनए संकर फार्म और शाही सेना से आनुवंशिक जानकारी के हस्तांतरण के जीनोमिक डीएनए के लिए खमीर कोशिकाओं में प्रकट.

जीनोमिक डीएनए / आरएनए और डीएनए संकर की शाही सेना युक्त परिवर्तन का उपयोग कर oligonucleotides द्वारा जनरेशन

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